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一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用技术

技术编号:15514458 阅读:43 留言:0更新日期:2017-06-04 06:17
本发明专利技术公开了一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用,该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9532。本发明专利技术所用的发酵培养基:55~70 g/L甘露醇,3~6 g/L大豆蛋白胨,3~6 g/L牛肉膏,0.8~1.2 g/L NH

【技术实现步骤摘要】
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
本专利技术涉及一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法,及其在壳寡糖制备中的应用,属于生物

技术介绍
壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖类化合物,具有独特的生理活性和优越的功能性质,在食品、工业、医药和化工领域具有重要应用。壳聚糖酶(Chitosanase,EC3.2.1.132)是一类催化氨基葡萄糖间的β-1,4-糖苷键断裂,专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶,是在催化壳聚糖底物水解转化制备壳寡糖的产业化领域具有重要应用前景的酶类,尤其是在低分子量且高生理活性的壳寡糖制备方面的应用引人注目。根据其作用位点不同,壳聚糖酶可分为3类:1)水解GlcN-GlcN键及GlcNAc-G1cN键;2)只能水解G1cN-GlcN键;3)既可水解G1cN-GlcN键又可水解G1cN-GlcNAc键。所有壳聚糖酶有一个共同催化性质就是要求糖苷键的一侧至少有1个G1cN残基,而不能催化GlcNAc-G1cNAc键的断裂,不同生物来源壳聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成产物壳寡糖聚合度存在差异。壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌、蓝藻和植物等生物体中,而微生物是其最适的规模生产来源,选取产酶量高、易于培养且非致病来源生物体就显得尤为重要。本专利技术是在筛选获得一株促进海马健康养殖的芽孢杆菌(专利技术专利CN104232541A)的基础上,发现该菌株也高产壳聚糖酶,且其为益生菌,以此确定其培养方法,进一步应用于生物转化制造壳寡糖领域。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术存在的不足,提供一种芽孢杆菌HS17发酵生产高活性壳聚糖酶的培养方法及其应用,以解淀粉芽孢杆菌HS17为出发菌株,经液体发酵的方法生产壳聚糖酶,该酶可通过高效水解壳聚糖来生产高生理活性的壳寡糖。所用的芽孢杆菌HS17具有高产壳聚糖酶的特性,其保藏名称为:HS17,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2014年8月20日,保藏号为CGMCCNo.9532,分类命名:解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本专利技术是通过如下技术方案来实现的:(1)菌种活化:取试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于30℃、200rpm下活化24h至菌体混浊,制得活化种子液;进一步,所述的活化培养基(g/L):酵母粉3~6,蛋白胨8~12,磷酸二氢钾1~3,硫酸镁0.5~1.5,pH7.0~7.5,121℃灭菌20min备用。(2)发酵生产壳聚糖酶:按照7~10%(v/v)的接种量在灭菌后的优选发酵培养基中接入活化种子液,在180rpm的旋转摇床中培养,控制温度为28~30℃,发酵2~4d后培养完毕,发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用;或者在发酵罐中以65%的体积比例装入优选发酵培养基,经118℃蒸汽灭菌20min后,按照7~10%(v/v)的比例接入活化的菌种,控制发酵过程中的pH始终维持在pH6~7,调节培养温度在28~30℃,溶解氧维持在5%以上,经发酵2~4d后发酵完毕,经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用。进一步,所述得优选发酵培养基:55~65g/L甘露醇,3~6g/L大豆蛋白胨,3~6g/L牛肉膏,0.8~1.2g/LNH4NO3,0.4~0.8g/L(NH4)2SO4,1.5~2.5g/LMnSO4,3~5g/LMgSO4,1~3g/LNaH2PO4,2~4g/LK2HPO4,28℃,pH6.5,2.5~5g/L粉末壳聚糖,接种量7~10%(v/v)。本专利技术的培养方法与现有技术相比的有益效果在于:(1)壳聚糖酶的生物来源新型,制备壳寡糖的纯度高本专利技术涉及的是解淀粉芽孢杆菌HS17来源壳聚糖酶,对底物选择性强,酶解壳聚糖底物生成的壳寡糖产品纯度高(附图3),在获得高纯度壳寡糖单体时可节省大量的纯化成本,市场前景应用广阔。(2)培养方法简单解淀粉芽孢杆菌HS17的培养方法简单,培养容易且过程不易染菌;发酵罐培养过程中不需要复杂的补料工艺,适合工厂化放大生产。(3)培养方法切合实际,酶活提高幅度大采用本专利技术的培养方法,在实际发酵生产过程中的壳聚糖酶活力值,与初期的培养方法比较,其酶产量提高了40多倍,培养方法的产量突出。附图说明图1为芽孢杆菌HS17平板培养的胶体壳聚糖降解圈;图2为实施例3中的发酵培养曲线,其中▇为壳聚糖酶活力,○为菌体浓度OD600,★为发酵液的pH;图3为实施例4中的薄层层析定性分析,其中标号1为氨基葡萄糖标准品,标号2为酶解产物。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细描述,这些实施例用于理解而不是限制本专利技术的保护范围。本专利技术所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌HS17,其在添加壳聚糖的培养平板上能产生较大的降解圈(附图1),具有高产壳聚糖酶的能力。所用的壳聚糖酶活力测定方法:发酵液经10000rpm离心5min得发酵上清酶液,取一定量的上清酶液加水稀释至1mL,与1mL的壳聚糖底物溶液混匀后水浴(40℃)保温20min,再加DNS试剂3mL,沸水浴5min,定容至25mL后取4mL反应样液在5000rpm下离心10min。取离心后上清液以对照组作为空白在520nm处测定OD值,根据DNS标准曲线,计算其酶活力。所用的酶活力测定对照组处理:一定量的发酵上清酶液加水稀释至1mL,沸水浴5min灭活,再加入相同体积的壳聚糖溶液和DNS试剂,处理方法同样品组。所用的酶活计算方法:以单位体积(mL)单位时间(min)水解产生的氨基葡萄糖的umol数为酶活力的定义单位。所用的相对酶活力计算方法:每组中的样品酶活力/每组中的最大样品酶活力×100%。实施例1:芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的单因素优化菌种活化:取试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于30℃、200rpm下活化24h至菌体混浊,制得活化种子液;所用的活化培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,K2HPO42,MgSO41,用陈海水配制,pH7.2。单因素优化:活化种子液按照2%(v/v)接种量接入不同的发酵培养基后,在30℃、180rpm的摇床中发酵48h后测定壳聚糖酶活力。碳源对菌株产壳聚糖酶的影响见表1,可以看出甘露醇作为碳源发酵生产壳聚糖酶的效果最好。所用的发酵培养基配方(g/L):碳源20(其种类见表1),蛋白胨6,酵母粉4,氯化钠5,粉末壳聚糖5,陈海水配制,pH7.0。表1碳源对菌株产壳聚糖酶的影响氮源对菌株产壳聚糖酶的影响见表2,氮源种类对壳聚糖酶的表达具有一定影响,但是总体差异不大。考虑速效氮源有利于菌体快速生长,而有机氮源可在发酵后期持续发挥作用生产壳聚糖酶,故选取大豆蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3和(NH4)2SO4作为后续菌株HS17发酵优化的氮源。所用的初始培养基组分(g/L):甘露醇20,氮源5(其种类见表2),NaH2PO42,K2HPO43,粉末壳聚糖5,陈海水配制,pH7.0。表2氮源对菌株产酶的影响金属盐对菌株产壳聚糖酶的影响见表3。由表3可以看出,Cu2+对壳聚糖酶活力具有强抑制作用,其表达量较低。Mn2+和Mg2+应是芽孢杆菌HS17来源壳聚糖酶的激活因子,在此条件下的酶活值较高,故后续发酵优化添加本文档来自技高网...
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用

【技术保护点】
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用,其特征在于包括如下具体步骤:(1)菌种活化:取试管斜面保存的芽孢杆菌HS17菌种接种于活化培养基中,在30℃、200 rpm下培养至菌体浑浊,制得活化种子液;所述的活化培养基(g/L):酵母粉3~6,蛋白胨8~12,磷酸二氢钾1~3,硫酸镁0.5~1.5,pH 7.0~7.5;(2)发酵生产壳聚糖酶:灭菌后的优选发酵培养基,按照7~10%(v/v)的接种量接入活化的种子培养液,在180 rpm的旋转摇床中培养,控制温度为28~30℃,发酵2~4 d后培养完毕,经离心过滤除菌后即可作为酶液使用;或者采用发酵罐培养,以65%比例装入优选发酵培养基,经118℃蒸汽灭菌20 min后,按照7~10%(v/v)的比例接入活化的菌种,控制发酵过程中的pH维持在pH 6~7,调节培养温度在28~30℃,溶解氧维持在10%以上,经发酵2~4 d后发酵完毕,经离心过滤除菌后即可作为酶液使用。

【技术特征摘要】
1.一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用,其特征在于包括如下具体步骤:(1)菌种活化:取试管斜面保存的芽孢杆菌HS17菌种接种于活化培养基中,在30℃、200rpm下培养至菌体浑浊,制得活化种子液;所述的活化培养基(g/L):酵母粉3~6,蛋白胨8~12,磷酸二氢钾1~3,硫酸镁0.5~1.5,pH7.0~7.5;(2)发酵生产壳聚糖酶:灭菌后的优选发酵培养基,按照7~10%(v/v)的接种量接入活化的种子培养液,在180rpm的旋转摇床中培养,控制温度为28~30℃,发酵2~4d后培养完毕,经离心过滤除菌后即可作为酶液使用;或者采用发酵罐培养,以65%比例装入优选发酵培养基,经118℃...

【专利技术属性】
技术研发人员:程仕伟孙虎山高美玲王艳华赵彦翠李晓栋李海东
申请(专利权)人:鲁东大学
类型:发明
国别省市:山东,37

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