miRNA-155及其抑制剂在DC-CIK细胞培养方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了miRNA‑155及其抑制剂在DC‑CIK细胞培养方面的应用，miRNA‑155可以作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。申请人研究发现，miRNA‑155下调表达的DC‑CIK细胞比miRNA‑155正常表达的DC‑CIK细胞具有更高的杀伤力，而miRNA‑155下调表达的DC细胞与miRNA‑155正常表达的DC细胞的杀伤力基本一致，无显著性差异。这表明，miRNA‑155下调并不能直接提高DC细胞对白血病细胞的杀伤力，但是miRNA‑155下调的DC细胞可以通过共培养显著增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。申请人还发现，太子参环肽B和太子参环肽C为miRNA‑155的有效抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
miRNA-155及其抑制剂在DC-CIK细胞培养方面的应用
本专利技术属于免疫领域，涉及DC-CIK细胞的培养，具体涉及miRNA-155及其抑制剂在DC-CIK细胞培养方面的应用。
技术介绍
生物免疫疗法是通过从体外补充、诱导或活化机体内本来固有的生物应答调节系统，活化和调动具有细胞毒活性的生物活性细胞和细胞因子，以调整各种免疫杀伤性的生物反应。目前在免疫治疗方面研究应用较多的有淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、共培养免疫(DC-CIK)细胞、自然杀伤细胞型的淋巴细胞，其中DC和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，它们之间的相互作用所诱发的免疫应答是免疫抑瘤效应的中心环节[王志华等，CIK细胞治疗癌症：国际临床试验的现状及展望，中国肿瘤生物治疗杂志，2013，20(2):129-137]。DC首先在小鼠脾脏中发现，因其成熟时细胞表面伸出膜状或刺状突起而得名。DC的前体细胞为CD34+或CD14+细胞，存在于人骨髓、脐血中的CD34+或CD14+细胞，体外添加粒细胞-单核细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α的培养条件下可发育成DC，DC主要分为髓系DC和淋巴系DC，髓系DC包括CD34+干细胞来源的DC、单核细胞衍生的DC等。DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，表面具有丰富的有助于抗原呈递的分子，如主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ，共刺激分子B7-1、B7-2，细胞黏附分子1、3以及淋巴细胞功能相关抗原1、3等，能有效激活初始T细胞，引发机体长生抗肿瘤免疫反应。CIK是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群对肿瘤细胞有高度杀伤能力且具有不同细胞表型的异质细胞。其中CD3+CD56+细胞是CIK细胞群体中的主要效应细胞，被称为自然杀伤细胞型淋巴细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合体限制性杀瘤优点。因此，CIK细胞对多种不同组织来源的肿瘤细胞均有杀伤作用。体外试验结果表明，患者自身来源的CIK抗肿瘤活性明显强于自体淋巴细胞激活的杀伤细胞，动物体内实验结果也表明CIK对BALB/c裸鼠负荷的BEL-7402肝癌生长的平均抑制率明显高于杀伤细胞。虽然目前大量研究显示DC、DC瘤苗、CIK细胞有显著的抗肿瘤作用，但是临床应用发现单独应用DC、CIK细胞治疗肿瘤效果并不是很理想，肿瘤细胞对这些免疫效应细胞发生抵抗导致过继免疫疗效不佳。DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两部分，DC识别病原，激活获得性免疫系统，而CIK通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞。因此，设想可将CIK细胞和DC联合起来治疗恶性肿瘤，从而发挥协同抗肿瘤作用。实验研究还证实，DC-CIK共培养后其抗肿瘤活性明显高于单纯CIK。
技术实现思路
本专利技术首先提供miRNA-155作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用；其次提供miRNA-155抑制剂或含有该抑制剂的试剂或试剂盒在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用，并提供太子参环肽B和太子参环肽C作为有效miRNA-155抑制剂。本专利技术通过如下技术方案得以实现：miRNA-155作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。所述的应用指利用miRNA-155表达下调的DC细胞与CIK细胞共培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。miRNA-155抑制剂在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。进一步地，所述miRNA-155抑制剂为太子参环肽B。进一步地，所述miRNA-155抑制剂为太子参环肽C。一种含有miRNA-155抑制剂的试剂或试剂盒在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。进一步地，所述miRNA-155抑制剂为太子参环肽B。进一步地，所述miRNA-155抑制剂为太子参环肽C。本专利技术优点：本专利技术发现，miRNA-155下调表达的DC-CIK细胞比miRNA-155正常表达的DC-CIK细胞具有更高的杀伤力，而miRNA-155下调表达的DC细胞与miRNA-155正常表达的DC细胞的杀伤力基本一致，无显著性差异。这表明，miRNA-155下调并不能直接提高DC细胞对白血病细胞的杀伤力，但是miRNA-155下调的DC细胞可以通过共培养显著增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。因此，miRNA-155可以作为药物靶标用于提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。本专利技术提供了两种天然化合物作为miRNA-155有效抑制剂，天然化合物来源比合成的核苷酸类siRNA具有更高的化学稳定性。附图说明图1为抑制组、对照组和阴性对照组DC细胞miRNA-155的相对表达量；图2为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；图3为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；图4为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：miRNA-155对DC-CIK细胞共培养的影响一、实验材料1、miRNA-155inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列1)；inhibitornegativecontrol由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列2)。序列1：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；序列2：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。2、肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。二、实验方法1、效应细胞DC与CIK的分离培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。(2)DC细胞的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d，收集细胞备用。(3)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。2、效应细胞DC的转染转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种DC细胞于本文档来自技高网...

【技术保护点】
miRNA‑155作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。

【技术特征摘要】
1.miRNA-155作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：利用miRNA-155表达下调的DC细胞与CIK细胞共培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。4.miRNA-155抑制剂在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32