一种人胎盘运输提取液及其替代胎牛血清制得的培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种人胎盘运输提取液，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：取合格的胎盘置于胎盘运输缓冲液中，4℃静置2～4h，收集上清液，离心，再经不同孔径的滤膜过滤，得到所述的人胎盘运输提取液。本发明专利技术还公开了利用人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基及其在培养间充质干细胞的应用。本发明专利技术避免了使用胎牛血清作为培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题；并可连续培养胎盘来源的多种自体间充质干细胞，建立自体间充质干细胞库，用于治疗自身免疫或炎症相关疾病，具有制备工艺简单、提取量大和成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种人胎盘运输提取液及其替代胎牛血清制得的培养基
本专利技术属于干细胞培养
，特别涉及一种人胎盘运输提取液及其替代胎牛血清制得的培养基。
技术介绍
牛血清(胎牛血清和小牛血清)是培养细胞最重要的添加物，在各类细胞培养及生产中占据主导地位。然而，使用牛血清培养人细胞，特别是用于临床治疗的细胞，具有非常明显的缺点，包括：牛血清中可能含有疯牛病病毒、朊病毒等污染源，牛血清培养的人细胞会产生显著的免疫排斥反应，残留的牛血清白蛋白导致人体产生抗体及炎症等。有研究显示，牛血清培养的人细胞能吞噬牛血清蛋白成分，即使在多次且较长时间洗涤下仍然有较多的残留，足以诱导人产生免疫反应。因此，很多国家限制使用牛血清培养人细胞用于治疗。寻找合适的替代牛血清的添加物是进行细胞治疗的必要步骤，这些替代物包括添加生长因子的无血清培养基、人血小板裂解液、人自体及异体血清。其中，无血清培养基成分确定，但是价格昂贵，并非适合所有细胞类型。血小板裂解液具有类似人血清的功能，但是血小板数量少，来源匮乏，需要反复冻融处理释放内容物；而人自体血清相对于其他添加物具有明显的优势，如人自体血清培养自身细胞不会产生免疫反应，富含细胞生长所需的各种生长因子，有效的促进细胞生长和维持特性。到目前为止，采用自体血清培养成功的细胞类型，包括人树突状细胞(DC细胞)，雪旺细胞，上皮/内皮细胞，造血干祖细胞，类肝细胞，人骨髓、脐血、脂肪、软骨等来源的间充质干细胞。这些细胞培养过程中一般均采用牛血清为对照，对人自体/异体血清的培养性能进行了比较，包括生长速率、传代数、表面标记、分化潜能等。在基础研究方面，也对细胞的信号通路、表达谱、分子机制进行探索；整体的培养方面，有些研究认为自体血清优于小牛血清(FCS)，有些研究认为自体血清与FCS效果相当，有些研究表明FCS要好于自体血清。长期培养脂肪干细胞，采用人血清能加速扩增，延长寿命和克隆形成能力，表明应用性良好。将人的脂肪干细胞冻存4年后，采用5％人血清培养，从p2到p8代，细胞增殖速率加快，其中p5代细胞具有最佳的表面标记分布。在生长速率的比较上，树突状细胞用自体血清培养诱导仅为同浓度的胎牛血清(FBS)的得率的一半。人雪旺细胞用自体血清培养后，倍增时间为10.33天，比使用FBS的缩短1.4天。人内皮祖细胞的培养上，两者在生长及形态等各方面没有差别。StuteN等培养人间充质干细胞，采用低密度接种，3天内发现10％自体血清生长最好，优于10％FCS，且效果约等于3％人自体血清，到对数期时，仍然是自体血清快于FCS。同样的，在培养脂肪干细胞时，比较研究显示，第二代扩增速率产生显著差异，10％自体血清大于10％FBS，10％FBS约等于5％自体血清。培养人脂肪来源的干细胞，同时比较了FBS、人胎盘血清、自体血清和异体血清，在扩增效率方面，自体血清与人胎盘血清类似，优于异体血清，远好于FBS(见：StuteN，etal.ExpHematol.2004.32(12)：1212-1225)。经过血清培养后，干细胞的分化能力也进行了对比，不同的细胞对人血清的反应能力不同，分化方向也发生一些变化。用人血清培养间充质干细胞，对数期的表面标记没有差别，但是成骨分化能力上，人血清的比牛血清的好，在脂肪分化方面，则是FBS的更好；OreffoRO等的结果则是人血清促进了成骨和脂肪的分化能力(见：OreffoRO，etal.EurJCellBio1.1997.74：251-261)，有的研究通过成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)计数和碱性磷酸酶(ALP)阳性克隆计数表明具有相似的成骨分化能力(见：WolfF，etal.EurCellMater.2008.15：1-10.)。体外培养的细胞在第四代是分化能力产生显著差异，10％FBS的优于10％自体血清的，在体内两者则相差不大。另外的研究则显示培养到p6代，脂肪干细胞能有效的分化成脂肪和软骨细胞，但是成骨细胞形成能力减弱。分离的软骨细胞经过人自体血清培养后，仍然具备分化成软骨的能力，可以体外形成软骨块进行移植。通过上述的多个研究组的多例比较实验，人自体血清具有FBS类似的培养细胞的功能。在来源方面，MizunoN等简化了自体血清采集方法，他们用完全密封的无菌装置收集血清，并完成离心和分装，收集到的血清无需过滤除菌就可直接使用，并被成功用于骨髓间充质细胞的培养(见：MizunoN.etal.CellBiolInt.2006，30(6)：521-524.)。显然这种渠道获得范围很窄。人胎盘，又称紫河车，是常用的一种中药，中医认为胎盘是一种气血双补的良药。现代生物学和医学证明，胎盘中含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分。迄今为止，已有多种细胞生长因子从胎盘组织中分离出来，包括血小板源内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、转化生长因子、促细胞生长因子等。研究表明：胎盘提取液中含有多种细胞因子，可以促进细胞的生长；胎盘提取液可促进成纤维细胞、脐带血造血干细胞、人羊膜间充质干细胞的生长；人胎盘组织液可以通过提高抗氧化能力和减少细胞凋亡来延缓大鼠衰老。目前，储存胎盘干细胞时，同时提供了整个胎盘，胎盘包含胎盘血，是一个稳定的自体血清来源方式；此外，提取胎盘间充质干细胞只使用一小部分胎盘组织，剩余的胎盘组织往往被浪费掉，冻存的组织使用率微乎其微。因胎盘中含有多种细胞因子，可以从剩余的胎盘组织中制备胎盘提取物，添加到培养间充质干细胞的培养基中，促进细胞的增殖和延缓细胞的衰老。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种人胎盘运输提取液，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本专利技术的第二目的是提供一种利用人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本专利技术的第三目的是提供一种上述培养基在培养间充质干细胞的应用，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本专利技术的技术方案如下：一种人胎盘运输提取液，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：无菌环境下，取合格的胎盘置于胎盘运输缓冲液中，4℃静置2～4h，收集上清液，离心，再经不同孔径的滤膜过滤，得到所述的人胎盘运输提取液。优选为，所述的胎盘运输缓冲液为6-10g/LNaCl，0.3-0.6g/LKCl，0.1-0.2g/LCaCl2，0.05-0.2g/LMgSO4，0.1-0.3g/LNa2HPO4·12HO2，0.04-0.1g/LKH2PO4，0.5-2g/L葡萄糖。优选为，所述的过滤步骤为依次经孔径为3um、1.6um、1.2u本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胎盘运输提取液，其特征在于，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：取合格的胎盘置于胎盘运输缓冲液中，4℃静置2～4h，收集上清液，离心，再经不同孔径的滤膜过滤，得到所述的人胎盘运输提取液。

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘运输提取液，其特征在于，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：取合格的胎盘置于胎盘运输缓冲液中，4℃静置2～4h，收集上清液，离心，再经不同孔径的滤膜过滤，得到所述的人胎盘运输提取液。2.根据权利要求1所述的一种人胎盘运输提取液，其特征在于，所述的胎盘运输缓冲液为6-10g/LNaCl，0.3-0.6g/LKCl，0.1-0.2g/LCaCl2，0.05-0.2g/LMgSO4，0.1-0.3g/LNa2HPO4·12HO2，0.04-0.1g/LKH2PO4，0.5-2g/L葡萄糖。3.根据权利要求1所述的一种人胎盘运输提取液，其特征在于，所述的过滤步骤为依次经孔径为3um、1.6um、1.2um、0.8um、0.65um、0.45um和0.22um的滤膜过滤。4.一种利用权利要求1～3所述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基，其特征在于，所述的培养基中含有所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊杰，李敏，邵小虎，陈彦田，齐念民，
申请(专利权)人：上海坤爱生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31