一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用，所述方法包括：通过兔粪便采集和分离纯化得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊，将所述兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊感染断奶仔兔，经过多次传代后得到潜隐期缩短的第N代兔中型艾美耳球虫卵囊，即兔中型艾美耳球虫早熟株；相对于兔中型艾美耳球虫野外流行株而言，本发明专利技术制备的兔中型艾美耳球虫早熟株纯净、且致病力较弱，可直接用于制备疫苗；并且本发明专利技术公开的兔中型艾美耳球虫早熟株制备方法简单易实现。

【技术实现步骤摘要】
一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用
本专利技术涉及艾美耳球虫应用领域，尤其涉及的是一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用。
技术介绍
兔球虫病是由孢子虫纲真球虫目艾美耳科艾美耳属的一种或几种艾美耳球虫寄生于兔肝胆管及肠道内引起的一种寄生性原虫病。该病给养兔业带来了极大的危害，严重阻碍养兔业的发展，我国把其列为二类动物疫病,与兔瘟、兔布氏杆菌病、兔疥螨病一同被称为四大兔病。据报道，我国约有41.9％的兔已感染球虫，在我国西北、东北和西南感染率竟然超过60％。所有品种的兔对该病都易感，其中以断奶后至3月龄幼兔的感染和发病最为严重，死亡率高达40％～70％，是养兔生产中常见的疾病。中型艾美耳球虫(Eimeriamedia)作为兔球虫其中的一个种，在兔养殖场中流行相当普遍，是引起兔球虫病的主要虫种。目前防治兔球虫的方法主要是采用抗球虫药进行药物防治，目前抗球虫药种类众多，防治效果参差不齐，往往容易引起耐药性以及食品安全问题等严重后果。研究发现无论是条件较差的养殖户还是管理较好的集约化兔场，不管用不用抗球虫药，均能在兔群检测到兔球虫。研制兔球虫疫苗不但可以有效控制兔球虫病，而且不会产生耐药性，没有食品安全方面的问题。目前，禁止在饲料中添加抗球虫药物的呼声也越来越高，使用兔球虫疫苗进行免疫预防必将替代现有的药物防治，占有主导地位。说明兔球虫疫苗具有广阔的市场应用前景。兔球虫是专性寄生性原虫，只对兔子产生致病性，因而十分安全；该病原物的使用较为简单，生产成本较低，在市场具有竞争优势。但是，兔球虫的野外流行株的致病力一般较强，不适合直接用于制备疫苗，因此对其进行早熟选育来降低兔球虫的毒力十分必要，兔艾美耳球虫早熟株的选育为兔球虫活疫苗的研制奠定基础。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用，旨在解决兔球虫的野外流行株致病力较强，不适合直接用于制备疫苗的问题。本专利技术的技术方案如下：一种兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，包括步骤：A、通过球虫分离方法获得兔粪中的混合种兔球虫卵囊；B、将混合种兔球虫卵囊转移至装有培养液的平皿中，孵育20～36h后，得到混合种兔球虫孢子化卵囊；C、对混合种兔球虫孢子化卵囊进行球虫纯化处理，得到兔中型艾美耳球虫强毒株，将兔中型艾美耳球虫强毒株放入培养液中孵育预定时间后，得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊；D、将预定量的兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊经口感染断奶仔兔；E、每隔一小时收集一次所述断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染断奶仔兔到第一次在断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第一次潜隐期；F、将从断奶仔兔的粪便中收集的兔中型艾美耳球虫卵囊培养成兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊，并将所述兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊经口感染新的断奶仔兔；G、每隔一小时收集一次所述新的断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染新的断奶仔兔到第一次在新的断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第二次潜隐期；H、重复上述传代过程，直到兔中型艾美耳球虫卵囊的第N次潜隐期时间比第一次潜隐期时间缩短20～26h时，则将第N次潜隐期的兔中型艾美耳球虫卵囊作为兔中型艾美耳球虫早熟株。较佳地，所述的兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，所述步骤A具体包括：A1、将收集的颗粒状兔粪捣碎，并加水混匀过滤，得到滤液；A2、将所述滤液进行离心处理，弃去上清液，保留沉淀；A3、将所述沉淀多次加水离心处理直到上清液澄清，将得到的沉淀用饱和食盐水溶解混匀，再次离心，收集上清液；A4、将所述上清液用水稀释，再次离心，收集沉淀，所述沉淀即为混合种兔球虫卵囊。较佳地，所述的兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，离心速度为2000～3000rpm/min。较佳地，所述的兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，所述培养液为0.5～3％的重铬酸钾溶液或0.5～3％的氯氨T溶液。较佳地，所述的兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，孵育温度为25～30℃。较佳地，所述的兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其中，所述步骤D中预定量为5000～100000个。一种兔中型艾美耳球虫早熟株，其中，采用上述任意一项兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法制备而成。一种兔中型艾美耳球虫早熟株的应用，其中，将上述兔中型艾美耳球虫早熟株用于制备疫苗。有益效果：本专利技术提供一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用，所述方法包括：通过兔粪便采集和分离纯化得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊，将所述兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊感染断奶仔兔，经过多次传代后得到潜隐期缩短的第N代兔中型艾美耳球虫卵囊，即兔中型艾美耳球虫早熟株；相对于兔中型艾美耳球虫野外流行株而言，本专利技术制备的兔中型艾美耳球虫早熟株纯净、且致病力较弱，可直接用于制备疫苗；并且本专利技术公开的兔中型艾美耳球虫早熟株制备方法简单易实现。附图说明图1为本专利技术一种兔中型艾美耳球虫早熟株制备方法佳实施例的流程图。具体实施方式本专利技术提供一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。请参阅图1，图1为本专利技术一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括步骤：S100、通过球虫分离方法获得兔粪中的混合种兔球虫卵囊；具体地，所述步骤S100具体包括：S110、将收集的颗粒状兔粪捣碎，并加水混匀过滤，得到滤液；具体地，将从田间采集到的含有兔中型艾美耳球虫的混合野毒株的兔粪捣碎，并加适量的蒸馏水或纯化水，混匀；接着用100目、300目的网筛过滤，回收粪渣，再加适量水混匀过滤，直至粪渣中的大部分卵囊都已经过滤出来；S120、将所述滤液进行离心处理，弃去上清液，保留沉淀；具体地，将过滤好的滤液在2000～3000rpm/min的转速下离心，弃去上清液，得到含有球虫卵囊的沉淀；S130、将所述沉淀多次加水离心处理直到上清液澄清，将得到的沉淀用饱和食盐水溶解混匀，再次离心，收集上清液；具体地，重复离心步骤，直至离心后的上清液澄清；将得到的沉淀用饱和的食盐水(或者同等浮力的硫酸镁溶液)溶解混匀，通过2000～3000rpm/min离心，收集上清液，直至沉淀中大部分的球虫卵囊都已经漂浮收集；S140、将所述上清液用水稀释，再次离心，收集沉淀，所述沉淀即为混合种兔球虫卵囊。具体地，按1份饱和食盐水加4～10份蒸馏水或纯化水的比例，稀释所述含有球虫卵囊的上清液，经2000～3000rpm/min离心，收集沉淀，所述沉淀即为混合种兔球虫卵囊。S200、将混合种兔球虫卵囊转移至装有培养液的平皿中，孵育20～36h后，得到混合种兔球虫孢子化卵囊；具体地，所述培养液为0.5～3％的重铬酸钾溶液或0.5～3％的氯氨T溶液，孵育温度为25～30℃；较佳地，将混合种兔球虫卵囊转移至装有培养液的平皿中，孵育温度为27℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、通过球虫分离方法获得兔粪中的混合种兔球虫卵囊；B、将混合种兔球虫卵囊转移至装有培养液的平皿中，孵育20～36h后，得到混合种兔球虫孢子化卵囊；C、对混合种兔球虫孢子化卵囊进行球虫纯化处理，得到兔中型艾美耳球虫强毒株，将兔中型艾美耳球虫强毒株放入培养液中孵育预定时间后，得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊；D、将预定量的兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊经口感染断奶仔兔；E、每隔一小时收集一次所述断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染断奶仔兔到第一次在断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第一次潜隐期；F、将从断奶仔兔的粪便中收集的兔中型艾美耳球虫卵囊培养成兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊，并将所述兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊经口感染新的断奶仔兔；G、每隔一小时收集一次所述新的断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染新的断奶仔兔到第一次在新的断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第二次潜隐期；H、重复上述传代过程，直到兔中型艾美耳球虫卵囊的第N次潜隐期时间比第一次潜隐期时间缩短20～26h时，则将第N次潜隐期的兔中型艾美耳球虫卵囊作为兔中型艾美耳球虫早熟株。...

【技术特征摘要】
1.一种兔中型艾美耳球虫早熟株的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、通过球虫分离方法获得兔粪中的混合种兔球虫卵囊；B、将混合种兔球虫卵囊转移至装有培养液的平皿中，孵育20～36h后，得到混合种兔球虫孢子化卵囊；C、对混合种兔球虫孢子化卵囊进行球虫纯化处理，得到兔中型艾美耳球虫强毒株，将兔中型艾美耳球虫强毒株放入培养液中孵育预定时间后，得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊；D、将预定量的兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊经口感染断奶仔兔；E、每隔一小时收集一次所述断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染断奶仔兔到第一次在断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第一次潜隐期；F、将从断奶仔兔的粪便中收集的兔中型艾美耳球虫卵囊培养成兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊，并将所述兔中型艾美耳球虫孢子化卵囊经口感染新的断奶仔兔；G、每隔一小时收集一次所述新的断奶仔兔的粪便，并检查所述粪便中是否有兔中型艾美耳球虫卵囊，把从感染新的断奶仔兔到第一次在新的断奶仔兔的粪便中检查到兔中型艾美耳球虫卵囊的时间间隔记为所述兔中型艾美耳球虫卵囊的第二次潜隐期；H、重复上述传代过程，直到兔中型艾美耳球虫卵囊的第N次潜隐期时间比第一次潜隐期时间缩短20～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽丹，廖贵城，翁亚彪，刘园，王新秋，黄仕凤，欧瑶瑶，
申请(专利权)人：佛山市正典生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44