一种双响应环状荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双响应环状荧光探针及其制备方法和应用。所述探针包含凋亡酶特异性识别多肽序列，能量转移分子荧光对和还原响应化学键组成。其中多肽序列和还原性化学键分别对凋亡酶和还原性谷胱甘肽响应，而发光基团的荧光通过能量共振转移实现荧光猝灭。该荧光探针，在只有还原性谷胱甘肽或者凋亡酶存在时不发射荧光，可以实现对还原性谷胱甘肽和凋亡酶同时存在条件下的精确检测。其制备简单易行，产率高，提纯简单，具有良好的生物相容性；还可以作为一种通用的荧光探针，广泛应用于凋亡酶抑制剂的筛选，抗癌药物治疗评价，肿瘤细胞凋亡成像，肿瘤或者疾病的准确诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种双响应环状荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种双响应环状荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
谷胱甘肽是细胞内富含的巯基小分子，通过氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的动态平衡调节作用维持细胞内氧化还原的平衡，起到抗氧化作用。不仅如此，谷胱甘肽的表达与疾病和癌症的发生有着紧密的关系，在一些肿瘤细胞内谷胱甘肽都有更高水平的表达。不仅如此，谷胱甘肽同样参与和调控细胞程序死亡，研究表明肿瘤细胞谷胱甘肽的过表达会增强细胞对于化疗药物的抗性。因此，人们设计了一系列基于谷胱甘肽敏感的智能型药物控释载体和荧光探针，用于肿瘤的靶向治疗和分析检测。而在谷胱甘肽的分析检测中，荧光检测法相对于高效液相色谱法、分光光度法和酶转化法更为灵敏、简便、快捷，而智能型荧光探针的设计将进一步推进谷胱甘肽的分析检测。凋亡酶在细胞生长、分化和凋亡整个过程中都扮演重要角色。凋亡酶-3是凋亡酶家族中的执行凋亡酶，激活的凋亡酶-3可以识别和切断含特定序列的多肽或者蛋白，从而影响细胞的生命代谢。其中，在肿瘤治疗过程中采用的化疗药物(阿霉素，喜树碱，顺铂等)、光动力学治疗药物(酞菁和卟啉等)、光热治疗药物(金纳米棒，吲哚菁绿等)以及基因治疗药物，凋亡酶-3均起着调控细胞的主要作用。因此，凋亡酶-3的检测被作为肿瘤治疗响应的早期信号，被广泛应用于早期肿瘤治疗效果的评价，推进和优化肿瘤治疗方案，促进个性化治疗的发展。基于对特异性多肽序列的识别和切断作用，一系列的分子荧光探针用于凋亡酶-3的检测和分析。但是，细胞凋亡是调控和维持细胞正常生命周期的程序死亡过程，正常细胞和肿瘤细胞在凋亡过程中同样表达凋亡酶-3。而这种非特异性的荧光变化将会对复杂的样品分析产生干扰，也将不能满足未来对于肿瘤精确治疗和个性化治疗的发展要求。为了满足对于复杂样品的测试需求，也为了满足肿瘤精确和个性化治疗的发展要求，亟需设计易制备的针对谷胱甘肽和凋亡酶具有高选择性和灵敏度的荧光探针。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种还原型谷胱甘肽和凋亡酶双响应环状荧光探针，所述的荧光探针为分子内环状多肽荧光探针，包含还原性双硫键，凋亡酶-3特异性识别序列以及能量共振转移分子荧光对。本专利技术的原理如下：当双响应环状荧光探针在只有还原型谷胱甘肽或者凋亡酶-3存在的情况下，环状荧光探针内部对应的特异性敏感键被相应切断，但是不会导致分子内能量共振转移的终止。只有当荧光探针在还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3同时存在的情况下，环状荧光探针内部对应的特异性敏感键全被切断，导致能量共振转移的终止，实现荧光的恢复，见图1。进一步地，本专利技术提供的双响应环状荧光探针中的能量共振转移分子荧光对为荧光素和二甲氨基偶氮苯、二甲氨基偶氮苯和四甲基罗丹明、四甲基罗丹明和荧光素中的任意一种。进一步地，本专利技术提供的双响应环状荧光探针，还包含穿膜肽序列。进一步地，本专利技术提供的双响应环状荧光探针的化学结构式如式(Ⅰ)所示：其中n＝0或4。本专利技术双响应环状荧光探针的整个合成过程采用固相多肽合成技术，制备方法简单，提纯过程简便。本专利技术还提供了用于同时检测还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3的试剂盒，包括：所述的双响应环状荧光探针。本专利技术另外提供了所述的双响应环状荧光探针在筛选能够同时抑制还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3药物中的应用。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针利用能量共振转移技术，具有较高的荧光猝灭效率和较好的还原型谷胱甘肽/凋亡酶-3响应效率，使该荧光探针具有良好的信噪比，见图2。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在只有还原型谷胱甘肽或者凋亡酶-3存在下荧光不恢复，而在还原型谷胱甘肽作用后加入凋亡酶-3，荧光快速恢复，证明该荧光探针对还原型谷胱甘肽和凋亡酶-2的快速和同时相应的特点，见图3。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在没有还原型谷胱甘肽和凋亡酶存在的情况下具有良好的稳定性，并且在具有凋亡酶-3抑制剂存在的情况下也没有荧光恢复，证明环状荧光探针具有良好的稳定性，良好的还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3响应性，以及凋亡酶-3特异性的特点，见图4。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在与还原型谷胱甘肽和不同凋亡酶-3浓度作用下，荧光强度随培养时间增长而增强，见图5。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在一定还原型谷胱甘肽和不同浓度凋亡酶-3的作用一定时间的条件下，荧光恢复随凋亡酶-3的浓度增加而增加，见图6。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在一定还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3的作用下，荧光恢复和作用时间具有良好的线性关系，见图7。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在还原型谷胱甘肽和一定浓度凋亡酶-3的作用一定时间的条件下，荧光恢复和凋亡酶-3的浓度具有良好的线性关系，见图8。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，对于肿瘤细胞和正常细胞都具有较低的毒性，可以用于细胞和生物体的检测，见图9。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在细胞培养基和胰酶中具有良好的稳定性，而且只在还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3同时存在时具有良好的响应性，见图10。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，可以通过荧光变化用以实时监测星形孢菌素诱导的细胞凋亡，见图11。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，在活细胞凋亡监测过程中具有良好的响应性和敏感性，见图12。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，可以用于肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡，对治疗效果进行评价，见图13。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，其荧光强度可以用以评估不同药物的化学治疗效果，见图14和图15。本专利技术的一个实施例显示所属的环状荧光探针，对不同程度的细胞凋亡都具有良好的响应性，见图16。本专利技术的优点是：1)整个合成过程采用固相多肽合成技术，制备方法简单，提纯过程简便。2)通过分子内双重键合，可以有效的提高能量共振转移的效率，从而提高荧光探针的信噪比。3)这种双响应环状荧光探针对还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3具有很好的响应性和特异性，在不满足还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3同时存在的情况下不具有荧光恢复，并且具有良好的稳定性。4)这种双响应环状荧光探针的设计思路，可以广泛的应用于多重响应型荧光探针的设计，极大的提高荧光探针在复杂分析检测应用中的准确性。5)这种荧光探针具有良好的生物相容性，对细胞的毒性较小，可以用于还原型谷胱甘肽和凋亡酶-3抑制剂的筛选，肿瘤的精确诊断，实时监测活细胞中抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡，对治疗效果进行评价。附图说明图1双响应环状荧光探针的分子设计及响应机理。图2环状荧光探针1与谷胱甘肽和凋亡酶-3作用前后荧光光谱图。图3环状荧光探针1分别在谷胱甘肽、凋亡酶-3、谷胱甘肽作用5小时候加入凋亡酶-3的情况下的相对荧光强度。图4环状荧光探针1分别在谷胱甘肽和凋亡酶-3、谷胱甘肽和凋亡酶-3抑制剂孵育过的凋亡酶-3、不含谷胱甘肽和凋亡酶-3的条件下的相对荧光强度。图5环状荧光探针1分别在谷胱甘肽和(A)0.5U，(B)0.3U，(C)0.2U，(D)0.05U，(E)0.025U凋亡酶-3浓度作用条件下的荧光光谱。图6环状荧光探针1分别与谷胱甘肽和不同凋亡酶-3浓度作用(A)2小时，(B)3小时和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种还原型谷胱甘肽和凋亡酶双响应环状荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为分子内环状多肽荧光探针，包含还原性双硫键，凋亡酶‑3特异性识别序列以及能量共振转移分子荧光对。

【技术特征摘要】
1.一种还原型谷胱甘肽和凋亡酶双响应环状荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为分子内环状多肽荧光探针，包含还原性双硫键，凋亡酶-3特异性识别序列以及能量共振转移分子荧光对。2.根据权利要求1所述的还原型谷胱甘肽和凋亡酶双响应环状荧光探针，其特征在于，所述的能量共振转移分子荧光对为荧光素和二甲氨基偶氮苯、二甲氨基偶氮苯和四甲基罗丹明、四甲基罗丹明和荧光素中的任意一种。3.根据权利要求1所述的还原型谷胱甘肽和凋亡酶双响应环状...

【专利技术属性】
技术研发人员：张先正，李仕颖，成红，曾旋，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42