一种近红外及双光子双模式成像荧光探针及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种近红外及双光子双模式成像荧光探针的制备及应用，属于化学生物学技术领域。本发明专利技术的近红外及双光子双模式成像荧光探针是以尼罗红衍生物和生物素为原料合成的，是一种棕色产物。本发明专利技术的荧光探针，具有良好的光谱性质，分别用540nm和590nm作为激发波长，在660nm处出现最大发射波长，且荧光强度较高。本发明专利技术的荧光探针，还对肿瘤细胞有靶向作用，是一种靶向近红外荧光探针；一方面在不破坏组织样品的前提下能够实现实时检测体内信号；另一方面能够提高信号在肿瘤内的富集，提高信噪比。本发明专利技术的荧光探针既可以进行近红外成像，同时也能够进行双光子成像，两种模式相互验证，能提高结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种近红外及双光子双模式成像荧光探针及其制备和应用
本专利技术涉及一种近红外及双光子双模式成像荧光探针的制备及应用，属于化学生物学

技术介绍
癌症是最严重威胁人类健康和生命的疾病问题之一，最新数据统计分析，2015年中国有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例。因此，及时发现原位肿瘤，以及手术后残余的肿瘤，并能尽早控制肿瘤是目前的一个巨大挑战，探索有效快速的方法来探测肿瘤对癌症治疗至关重要。临床诊断检测肿瘤主要方式包括磁共振成像（MagneticResonanceImaging,MRI）、正电子体层成像（PositronEmissionTomography,PET）和X-射线等，在一定程度上这些方式缺少一定的靶向性和灵敏度，并且伴随着一定的辐射损伤。光学成像（OpticalTomography）是近几年新兴的有前途的癌症诊断检测方式。光学成像能够实时高分辨无损伤检测癌症，并且这种光学信号能够提供分子生物学信息和肿瘤相关结构以及肿瘤的代谢，为下一步的诊断治疗提供一定的依据。在光学成像技术中，有机小分子荧光染料尤其是近红外荧光染料（Near-Infrared,NIR）在肿瘤的诊断治疗领域中展现出了巨大的潜力，对于肿瘤的诊疗具有身份重大的意义。近红外荧光探针（发射波长：650-900nm）能够避免血红蛋白、色素、胆红素等物质在可见光区（400-650nm）强吸收，有较低的背景干扰，能够在活体生物组织内实时通过深穿透能力的荧光监测成像效果。因此，近红外染料在肿瘤的诊断中已经得到广泛的研究与应用。尼罗红（Nile）染料是近红外染料中的一种，激发波长和发射波长分别为600nm和670nm。这使得尼罗红在体内外成像时能够降低体内自身背景的干扰，提高信噪比。此外，尼罗红还具有双光子性质，双光子成像采用飞秒激光器作为激发光源，采用长波长的近红外作为激发波长对组织细胞的损伤较小，能够同时吸收两个光子聚焦在微小的点上，能够进行更清晰地成像。因此，尼罗红染料可以同时进行近红外和双光子双模式成像，使得活体和组织成像相互验证，提高信号的准确性。但是，采用尼罗红作为近红外荧光染料进行细胞成像时，尼罗红本身不具有靶向性，在体内的正常组织和肿瘤细胞中均能够成像，容易造成假阳性，不利于肿瘤检测。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种对肿瘤细胞具有靶向性的近红外及双光子双模式成像荧光探针及其制备和应用。技术方案一种近红外及双光子双模式成像荧光探针，其化学结构式如式I所示：式I中，R1=R2=CH3。一种上述近红外及双光子双模式成像荧光探针的制备方法，是将化合物2、化合物3、1-羟基苯并三唑（HOBT）、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合进行反应，反应结束后分离纯化，得棕色产物；化合物2的结构式：，化合物3的结构式：。所得棕色产物即为本专利技术的近红外及双光子双模式成像荧光探针。上述制备方法，可以采用薄层色谱分析检测法（TLC）检测反应进程，或者，反应24h以上。上述制备方法，可以使用硅胶柱进行分离纯化。上述近红外及双光子双模式成像荧光探针的应用，用于细胞的荧光成像或/和双光子成像。上述应用，包括根据荧光成像或/和双光子成像结果，判断细胞是否是阳性细胞；所述阳性细胞为生物素受体表达高于正常细胞的细胞。本专利技术的荧光探针，具有良好的光谱性质。化合物1（尼罗红）和化合物2（尼罗红衍生物）在DMSO:PBS(1:9)和EtOH:PBS(1:9)体系中的最大吸收光谱均在590nm处；本专利技术的探针除了在590nm处有吸收，还在540nm处出现了最大吸收峰，出现了蓝移，可能是生物素的加入影响了化合物2对光谱的吸收。荧光光谱中，分别用540nm和590nm作为激发波长，在DMSO:PBS(1:9)和EtOH:PBS(1:9)体系中都在660nm处出现了最大发射波长，与化合物1和2的最大发射波长和峰型保持一致，充分说明生物素的加入并没有影响化合物2的荧光性质。与此同时，在相同浓度下，本专利技术的荧光探针的荧光强度还强于化合物1和2，由此可以看出生物素在本专利技术中还具有一定的增强荧光强度的作用。本专利技术研究了本专利技术的荧光探针对活细胞的毒性：采用MTT比色法，通过分析细胞在加入探针之后的存活率，讨论探针对细胞的毒性。在此基础上，应用本专利技术的荧光探针对活细胞、活组织和活动物进行成像研究，检测探针在阳性细胞和阴性细胞中的成像差别，在活组织中的近红外和双光子双模式成像效果以及在阳性肿瘤模型中的成像效果。实验证明：本探针没有毒性。另外，本专利技术的荧光探针，在具备良好光谱性质的同时还对肿瘤细胞有靶向作用，是一种靶向近红外荧光探针；一方面在不破坏组织样品的前提下能够实现实时检测体内信号；另一方面能够提高信号在肿瘤内的富集，提高信噪比。本专利技术的荧光探针，既可以进行近红外成像，同时也能够进行双光子成像，两种模式相互验证，能提高结果的准确性。本专利技术的有益效果为：本专利技术的荧光探针，具有良好的荧光发射光谱特性（630-690nm），同时也能够进行双光子成像，两种模式相互验证，能提高结果的准确性；对肿瘤细胞有靶向作用，能够提高信号在肿瘤内的富集，提高信噪比；能在不破坏组织样品的前提下能够实现实时检测体内信号。本专利技术的荧光探针，可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。附图说明图1是本专利技术的荧光探针的HRMS图谱；图2是本专利技术的荧光探针的荧光光谱图；图3是阳性细胞在各荧光探针中的荧光成像图及竞争实验荧光成像图；图4是图3对应的荧光强度；图5是阴性细胞在各荧光探针中的荧光成像图；图6是图5对应的荧光强度；图7是本专利技术的荧光探针的活组织近红外和双光子双模式成像图；图3中，第一排为N-BN的成像结果：a为细胞明场，b为单光子荧光图（Ex=561nm,Em=570-620nm），c为a与b的组合,d为双光子荧光图（Ex=820nm,Em=570-620nm）；第二排为N-BN与生物素（biotin）的竞争成像结果：e为细胞明场，f为单光子荧光图（Ex=561nm,Em=570-620nm），g为e与f的组合,h为双光子荧光图（Ex=820nm,Em=570-620nm）；第三排为N-OH的成像结果：i为细胞明场，j为单光子荧光图（Ex=561nm,Em=570-620nm），k为i与j的组合,l为双光子荧光图（Ex=820nm,Em=570-620nm）；图4中，从左至右，依次为N-BN、N-BN与生物素、N-OH的单光子荧光强度，N-BN、N-BN与生物素、N-OH的双光子荧光强度；图5中，第一横排为N-BN的成像结果，第二横排为N-OH的成像结果；第一竖排为细胞明场，第二竖排为单光子荧光图（Ex=561nm,Em=570-620nm），第三竖排为第一竖排和第二竖排的叠加,第四竖排为双光子荧光图（Ex=820nm,Em=570-620nm）；图6中，从左至右，依次为N-BN、N-OH的单光子荧光强度，N-BN、N-OH的双光子荧光强度；图7中，上图为实施例1获得的棕色产物在肿瘤组织中的单光子近红外成像结果（NIRImaging），下图为实施例1获得的棕色产物在肿瘤组织中的双光子近红外成像结果（TPImag本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近红外及双光子双模式成像荧光探针，其化学结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种近红外及双光子双模式成像荧光探针，其化学结构式如式I所示：式I中，R1=R2=CH3。2.一种权利要求1所述近红外及双光子双模式成像荧光探针的制备方法，其特征在于，是将化合物2、化合物3、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺和N,N-二甲基甲酰胺混合，反应结束后分离纯化，得棕色产物；化合物2的结构式：，化合物3的结构式：；所得棕色产物即为近红外及双光子双...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，孔秀琪，董宝利，张楠，王超，宋学真，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37