抗PCSK9单克隆抗体制造技术

技术编号:15499900 阅读:374 留言:0更新日期:2017-06-03 22:00
本发明专利技术涉及抗体工程技术领域,具体公开了抗PCSK9的单克隆抗体。本发明专利技术包含编码所述抗体可变区和CDR区的氨基酸序列,以及获得方法和单克隆抗体的用途。本发明专利技术从噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9的单克隆抗体,通过链置换构建噬菌体库的方法进行亲和力成熟,先对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR1、2、3区突变建库筛选后,选取亲和力较高的单克隆抗体,再对其重链CDR1、2、3区突变建库进行筛选,最终筛选到了高亲和力的抗PCSK9的单克隆抗体。本发明专利技术所得到的PCSK9抗体对PCSK9具有良好的亲和力并能够抑制PCSK9与其配体的结合,可用于血脂异常、心脑血管疾病和血栓闭塞性疾病的治疗。

Anti PCSK9 monoclonal antibody

The invention relates to the technical field of antibody engineering, and specifically discloses a monoclonal antibody against PCSK9. The present invention comprises an amino acid sequence encoding the antibody variable region and a CDR region, and the use of the acquisition method and monoclonal antibodies. The present invention screened anti PCSK9 monoclonal antibody from a phage antibody library, method for constructing phage library by chain replacement in the affinity maturation, first on the light chain CDR1, screening the monoclonal antibody was 2 and 3 mutation database screening, selection of high affinity monoclonal antibody, then the heavy chain CDR1, 2 3, the mutation database screening, finally screened anti PCSK9 monoclonal antibody with high affinity. The PCSK9 antibody obtained by the invention has good affinity for PCSK9 and can inhibit the combination of PCSK9 and its ligands, and can be used for the treatment of dyslipidemia, cardiovascular and cerebrovascular diseases and thrombotic obliterans diseases.

【技术实现步骤摘要】
抗PCSK9单克隆抗体
本专利技术涉及抗体工程
,具体涉及本专利技术涉及全人源的抗PCSK9的单克隆抗体、及其获得方法与应用。
技术介绍
PCSK9(前蛋白转化酶枯草溶菌素9,Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9)属于前蛋白转化酶家族蛋白酶K亚家族。人PCSK9基因定位于染色体1p32.3,长约22kb,共有12个外显子,编码含692个氨基酸残基的蛋白质。PCSK9蛋白由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域(V结构域)组成,它作为可溶性的74kDa的前体合成,在内质网中经过自身催化裂解产生14kDa的前肽和60kDa的成熟的蛋白酶。PCSK9主要在肝脏、肠道和肾脏表达,皮肤和神经系统也有少量表达,但是只有肝脏中的PCSK9可以分泌到血液循环系统中。研究表明,PCSK9能介导低密度脂蛋白受体(LDLR)降解从而调节血浆中LDL胆固醇(LDL-C)水平,而LDLR介导肝内的LDL胞吞过程是从循环系统中清除LDL的主要途径。LDLR是1个多结构域的蛋白,胞外域与表皮生长因子前体同源结构域EGF-A、EGF-B、EGF-C紧连。PCSK9介导LDLR降解首先需要与LDLR结合,LDLR上结合位点主要是EGF-A,形成PCSK9与EGF-A复合物。有研究表明,PCSK9也可通过极低密度脂蛋白受体、载脂蛋白B受体、载脂蛋白E受体2调节胆固醇代谢,但其中的分子机制并不明确。基础研究和临床试验表明,通过外源性的干预措施抑制PCSK9活性,可以加速血浆中LDL的清除,从而达到降血脂的作用。目前PCSK9的抑制剂主要包括单克隆抗体、反义核苷酸、小分子干扰RNA、模拟肽和小分子抑制剂等。单克隆抗体药物是今年生物医药领域的研发热点,具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点,代表了药品治疗领域的最新发展方向。以PCSK9为靶标的单克隆抗体可以与PCSK9发生特异性结合,阻断PCSK9与LDLR的相互作用,减慢LDLR的降解过程从而发挥降低LDL-C水平的作用。临床实验数据显示了抗PCSK9单抗药物的安全性、有效性及独特的临床应用价值。全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向。抗体库技术的出现为人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程,甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库,非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程,通常将抗原包被在固相介质上,加入待筛选的噬菌体抗体库,通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力特异的抗体。目前多家制药公司都在积极开发针对PCSK9的单抗药物。安进的Repatha(evolocumab)和赛诺菲/再生元的Praluent(alirocumab)均为全人源抗体,已于2015年先后被批准上市,用于原发性高胆固醇血症和家族性高胆固醇血症(杂合子和纯合子)的治疗。在他汀基础上加用Evolocumab可使原发性高胆固醇血症患者的LDL-C降低77%,杂合子家族性高胆固醇血症患者的LDL-C降低68%,纯合子家族性高胆固醇血症患者的LDL-C降低31%。evolocumab耐受性良好,目前无任何明显的安全性问题。辉瑞的人源化单抗bococizumab正在进行三期临床,诺华的人源化单抗lodelcizumab正在进行二期临床。罗氏及默沙东也在开展临床试验。目前国内该领域依然缺乏自主研发的具有高亲和力的抗PCSK9的全人源抗体。
技术实现思路
本专利技术提供了抗PCSK9的单克隆抗体;本专利技术从全合成抗体库中筛选出抗PCSK9的单克隆抗体,然后通过计算机辅助设计分析,构建小容量合成噬菌体抗体轻链库的方法,对筛选获得的抗PCSK9单克隆抗体的轻链的CDR1、2、3区突变建库;筛选后,选取亲和力较高的单克隆抗体,再对其重链CDR1、2、3区突变建库进行筛选,最终筛选到了高亲和力的抗PCSK9的单克隆抗体。本专利技术抗PCSK9抗体具有全新的序列,该抗体在体外特别是细胞水平上功能良好,极具医学应用前景。为实现上述目的,本专利技术一种抗PCSK9的单克隆抗体,包括:轻链和重链;所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示;并且所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示;LCDR1包含RASQSIDNRLT(SEQNO.22)、RASQSVRNWLD(SEQNO.23)、RASQGINSWLN(SEQNO.24)、RASQNVNNWLN(SEQNO.25)、RASQNINSWLN(SEQNO.26)、RASQNINNWLN(SEQNO.27)、RASQGIHNWLN(SEQNO.28)、RASQDVDSWLT(SEQNO.29)、RASQSVRNWLN(SEQNO.30)、RASQDVRNWLT(SEQNO.31)或RASQSIRSYLN(SEQNO.32)中的任一种;LCDR2包含DASSRQS(SEQNO.33)、GASTLES(SEQNO.34)、AASTRET(SEQNO.35)、GASSRQS(SEQNO.36)、GASTRPT(SEQNO.37)、DASNRQS(SEQNO.38)、GASNLAS(SEQNO.39)、DASNLQS(SEQNO.40)或DASSRPT(SEQNO.41)中的任一种;LCDR3包含QQPENDPTT(SEQNO.42)、QQDNDIPLT(SEQNO.43)、QQWNNTPNT(SEQNO.44)、QQDNDMPLT(SEQNO.45)、QQWFDVPTT(SEQNO.46)、QQWDDTPNT(SEQNO.47)、QQNSNIPLT(SEQNO.48)、QQDSKIPLT(SEQNO.49)、QQWTDTPLT(SEQNO.50)、QQDDSTPPT(SEQNO.51)或QQGDSMPMT(SEQNO.52)中的任一种;HCDR1包含GGTFTNNA(SEQNO.53)、GYTVTSYG(SEQNO.54)或GYSLTSYG(SEQNO.55)中的任一种;HCDR2包含RIIPMFGMA(SEQNO.56)、WLSFYNGNT(SEQNO.57)、WVTFYNGNT(SEQNO.58)、WVSFYQGNT(SEQNO.59)、WVSFYNGQT(SEQNO.60)或WVSFYNGNS(SEQNO.61)中的任一种;HCDR3包含AREGIPMI(SEQNO.62)、ARGYSLDV(SEQNO.63)、ARGYGMSI(SEQNO.64)、ARGFGMDR(SEQNO.65)、ARGYGMTV(SEQNO.66)或ARGFGLSV(SEQNO.67)。其中,所述轻链可变区氨基酸序列优选SEQNO.11、SEQNO.12、SEQNO.13、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.17、SEQNO.18、SEQNO.19、SEQNO.20或SEQNO.21中的任一种。其中,所述重本文档来自技高网
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抗PCSK9单克隆抗体

【技术保护点】
一种抗PCSK9的单克隆抗体,其特征在于,包括:轻链和重链;所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示;并且所述重链的互补决定区CDR1,CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示;LCDR1包含RASQSIDNRLT、RASQSVRNWLD、RASQGINSWLN、RASQNVNNWLN、RASQNINSWLN、RASQNINNWLN、RASQGIHNWLN、RASQDVDSWLT、RASQSVRNWLN、RASQDVRNWLT或RASQSIRSYLN中的任一种;LCDR2包含DASSRQS、GASTLES、AASTRET、GASSRQS、GASTRPT、DASNRQS、GASNLAS、DASNLQS或DASSRPT中的任一种;LCDR3包含QQPENDPTT、QQDNDIPLT、QQWNNTPNT、QQDNDMPLT、QQWFDVPTT、QQWDDTPNT、QQNSNIPLT、QQDSKIPLT、QQWTDTPLT、QQDDSTPPT或QQGDSMPMT中的任一种;HCDR1包含GGTFTNNA、GYTVTSYG或GYSLTSYG中的任一种;HCDR2包含RIIPMFGMA、LSFYNGNT、VTFYNGNT、VSFYQGNT、VSFYNGQT或VSFYNGNS中的任一种;HCDR3包含AREGIPMI、ARGYSLDV、ARGYGMSI、ARGFGMDR、ARGYGMTV或ARGFGLSV中的任一种。...

【技术特征摘要】
1.一种抗PCSK9的单克隆抗体,其特征在于,包括:轻链和重链;所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示;并且所述重链的互补决定区CDR1,CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示;LCDR1包含RASQSIDNRLT、RASQSVRNWLD、RASQGINSWLN、RASQNVNNWLN、RASQNINSWLN、RASQNINNWLN、RASQGIHNWLN、RASQDVDSWLT、RASQSVRNWLN、RASQDVRNWLT或RASQSIRSYLN中的任一种;LCDR2包含DASSRQS、GASTLES、AASTRET、GASSRQS、GASTRPT、DASNRQS、GASNLAS、DASNLQS或DASSRPT中的任一种;LCDR3包含QQPENDPTT、QQDNDIPLT、QQWNNTPNT、QQDNDMPLT、QQWFDVPTT、QQWDDTPNT、QQNSNIPLT、QQDSKIPLT、QQWTDTPLT、QQDDSTPPT或QQGDSMPMT中的任一种;HCDR1包含GGTFTNNA、GYTVTSYG或GYSLTSYG中的任一种;HCDR2包含RIIPMFGMA、LSFYNGNT、VTFYNGNT、VSFYQGNT、VSFYNGQT或VSFYNGNS中的任一种;HCDR3包含AREGIPMI、ARGYSLDV、ARGYGMSI、ARGFGMDR、ARGYGMTV或ARGFGLSV中的任一种。2.根据权利要求1所述的抗PCSK9的单克隆抗体,其特征在于,所述轻链可变区氨基酸序列优选SEQNO.11、SEQNO.12、SEQNO.13、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.17、SEQNO.18、SEQNO.19、SEQNO.20或SEQNO.21中的任一种。3.根据权利要求1所述的抗PCSK9的单克隆抗体,其特征在于,所述重链可变区氨基酸序列优选SEQNO.1、SEQNO.2、SEQNO.3、SEQNO.4、SEQNO.5、SEQNO.6、SEQNO.7、SEQNO.8、SEQNO.9或SEQNO.10中的任一种。4.根据权利要求1所述的抗PCSK9的单克隆抗体,其特征在于,所述重链可变区HCDR1序列选自GYTVTSYG或GYSLTSYG的氨基酸序列;所述轻链可变区LCDR1序列选自RASQSVRNWLD、RASQNVNNWLN、RASQNINSWLN、RASQNINNWLN或R...

【专利技术属性】
技术研发人员:周海平李晓敏张稳文圣梅白义
申请(专利权)人:北京东方百泰生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:北京,11

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