一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种体内止血敷料的制备方法，该方法向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过设定的降温速度进行精确降温预冻，并真空冷冻干燥，然后Co60照射灭菌，最终获得一种体内止血敷料。本发明专利技术制备方法本发明专利技术所制备的体内止血敷料安全性高，生物相容性好，止血效果显著，可用作各类创面止血和术后止血，在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

Method for preparing internal hemostatic dressing using transglutaminase as cross-linking agent

The invention discloses a preparation method of in vivo hemostatic dressing, the method to human like collagen solution adding transglutaminase crosslinked after cooling by cooling the precise pre freezing speed setting, and vacuum freeze-drying, then Co60 irradiation sterilization, finally obtained an in vivo hemostatic dressing. The preparation method of the invention is the invention made in vivo hemostatic dressings were of high safety, good biocompatibility, hemostatic effect, and can be used as wound hemostasis and postoperative bleeding, has a good application prospect in biomedical materials and tissue engineering and other related fields.

【技术实现步骤摘要】
一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法
本专利技术涉及一种体内止血敷料的制备方法，特别涉及一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法，属于生物医用材料领域。
技术介绍
胶原蛋白是一种高分子蛋白，一般呈白色、不透明的纤维状。它是生物体组成结构的主要成分之一，广泛地分布于动物的皮肤、骨骼和肌肉组织内。胶原具有止血性能，一方面可加强血小板的黏附和聚集形成血栓，阻止血液流出。另一方面，通过激活和诱导各种凝血因子还可启动内源性的凝血途径。但是胶原蛋白多来源于动物皮、筋腱等，可加工性差，在提取过程中会使蛋白部分生物活性丧失，而且其对人体而言属于一种异源物，可引起过敏等不良反应，应用于人体非常容易产生排异反应。因此需要寻找一种制备简单、安全性高的胶原蛋白作为原料。谷氨酰胺转移酶是人体组织中本来就含有的一种酶，可与胶原蛋白发生交联反应，谷氨酰胺转移酶以肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基的供体，以多肽链中赖氨酰残基于氨基作为酰基的受体，形成蛋白质分子内和分子间的ε-γ（-谷氨酰）赖氨酸异肽键。热交联是在真空条件下加热，使胶原分子严重脱水，自由羧基和羟基发生酯化反应以及羧基与氨基之间发生酰胺反应，从而改善止血敷料的机械性能，而且还可以保持止血敷料的内部孔状结构不变，使孔隙均匀完整。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用安全、可吸收、止血效果好的体内止血敷料的制备方法。本专利技术的实现过程如下：一种体内止血敷料的制备方法：以类人胶原蛋白为原料，加入注射用水搅拌溶解后，向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过控制降温速率为4-8℃/min进行降温预冻，真空冷冻干燥，Co60照射灭菌后得到体内止血敷料。上述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。上述的类人胶原蛋白加入注射用水后的质量浓度为1%-5%；谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g。具体来说，上述的体内止血敷料的制备方法，包括如下步骤：（1）将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，使溶液中类人胶原蛋白的质量浓度为1%-5%；（2）将溶液移入一次性无菌培养皿或模具中，每皿或每模具7-15mL；（3）加入谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g，反应温度为-4-0℃，交联时间为24-48小时；（4）预冻过程中，降温速率控制为4-8℃/min；（5）样品冻干处理24-72h，冻干好的样品Co60照射灭菌10-30h。本专利技术具有以下优点：（1）本专利技术所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源性胶原蛋白，它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患等问题，具有生物相容性好、促细胞生长、无病毒隐患和免疫排异反应低等优点，提高了体内止血敷料的安全性；（2）本专利技术采用酶法交联，具体使用谷氨酰胺转氨酶交联胶原蛋白制备体内止血敷料，可以改善止血敷料的机械强度，提高止血效果，而且谷氨酰胺转移酶是人体组织中本身就含有的一种酶，其安全无毒，制备的止血敷料应用于临床时保证了其良好的生物安全性；（3）本专利技术所制备的体内止血敷料合成工艺简单易实现，产品质量稳定、安全性高，工艺易放大且重现性能好，在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。附图说明图1为体内止血敷料的外观图；图2为体内止血敷料的SEM图；图3为体内止血敷料兔耳止血效果图；图4为体内止血敷料兔肝脏止血效果图；图5为体内止血敷料细胞毒性实验图；图6为体内止血敷料皮下植入图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合，本领域普通技术人员通过阅读本专利技术说明书而对本专利技术技术方案采取的任何等效的变换，均为本专利技术的权利要求所涵盖。一种体内止血敷料的制备方法，包括如下步骤：（1）将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，搅拌使其完全溶解，使溶液中类人胶原蛋白的质量浓度为1%-5%，所述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白；（2）将溶液移入一次性无菌培养皿或模具中，每皿或每模具7-15mL；（3）加入谷氨酰胺转氨酶，加入谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g，反应温度为-4-0℃，交联时间为24-48小时；（4）使用程序冷冻仪预冻过程中控制降温速率为4—8℃/min进行精确降温，一直降至-40—-80℃；（5）在真空冷冻干燥机中冻干样品24-72h；（6）冻干好的样品通过辐照灭菌10-30h。本专利技术采用类人胶原蛋白为主要原料制备体内止血敷料，现有方法多采用超低温冰箱直接预冻，蛋白溶液直接置于低温，其中的液滴来不及反应而导致形成的冰晶杂乱无章，大小不一，在冻干时，冰晶升华而形成众多不均匀的孔，得到的体内止血敷料表面凹凸不平，边缘不整，机械强度差，止血功效低。而本专利技术中的预冻方法为按照设定的降温规律进行程序冷冻，冰晶的形成比较规律，当温度下降到一定程度时，首先形成许多晶核，随着温度继续下降，周围小液滴吸附到这些晶核表面后结晶，由于温度下降的速度恒定且一致，所有晶核的生长速率非常接近，最终形成形状大小接近的冰晶，冻干后得到大小接近的孔径，得到的体内止血敷料表面平整，孔径均一，机械强度大，在止血过程中不易被血流冲破而导致二次出血，大大提高了海绵的止血效果。此外，对程序冷冻仪的降温速率进行深入的研究，如果降温速率大于10ºC/min，温度跳跃就会比较大，其冰晶的形成必然受到一定的影响，如果降温速率小于3ºC/min，富集在晶核上的液滴不能被快速的冷冻而有流动的可能，这样所有的晶体大小形状也都不规则。本专利技术的研究降温速率控制在4-8℃/min，得到的材料物化性能和止血效果最佳。实施例1将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为2.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应24h，于程序冷冻仪中以-4℃/min的速度冻至-80℃，并保持2h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干24h，取出封装进行Co60辐照灭菌24h，获得体内止血敷料。制备的海绵孔隙率为92%，吸水率为1500%。实施例2将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为2.5%，谷氨酰胺转移酶的质量为4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应30h，于程序冷冻仪中以-4℃/min的速度冻至-80℃，并保持2h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干30h，取出封装进行Co60辐照灭菌24h，获得体内止血敷料。实施例3将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为4.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为6U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应40h，于程序冷冻仪中以-6℃/min的速度冻至-80℃，并保持2h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干48h，取出封装进行Co60辐照灭菌24h，获得体内止血敷料。实施例4将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为5.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为8U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应48h，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体内止血敷料的制备方法，其特征在于：以类人胶原蛋白为原料，加入注射用水搅拌溶解后，向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过控制降温速率为4‑8 ℃/min进行降温预冻，然后真空冷冻干燥，Co60照射灭菌后得到体内止血敷料。

【技术特征摘要】
1.一种体内止血敷料的制备方法，其特征在于：以类人胶原蛋白为原料，加入注射用水搅拌溶解后，向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过控制降温速率为4-8℃/min进行降温预冻，然后真空冷冻干燥，Co60照射灭菌后得到体内止血敷料。2.根据权利要求1所述的体内止血敷料的制备方法，其特征在于：所述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。3.根据权利要求2所述的体内止血敷料的制备方法，其特征在于：类人胶原蛋白加入注射用水后的质量浓度为1%-5%。4.根据权利要求2所述的体内止血敷料的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：范代娣，惠俊峰，米钰，马晓轩，马沛，刘琳，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61