一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，该技术方案基于实验手段研究发现研究表明纤维突起具有良好的免役原型，据此以4型禽腺病毒纤维蛋白C‑末端基因作为抗原物质，并在其天然序列的基础上进行了密码子优化，克隆入真核表达载体pCAGGS中，构建了DNA疫苗pCAGoptiFAV4C。本发明专利技术研究的禽腺病毒DNA疫苗采用了基因工程发酵的方法制备抗原，成本低，抗原纯净，使用安全。利用血清学方法和免疫攻毒法评价该疫苗的免疫效果，结果显示，该疫苗对禽能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。与传统疫苗相比，本发明专利技术的DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。

Group a type 4 avian adenovirus DNA vaccine and uses thereof

The invention provides a group of type 4 vaccine of avian adenovirus DNA and its application, the technical scheme based on experimental research shows that fiber protrusion has a way of finding a good prototype, according to the 4 type of avian adenovirus fiber protein C terminal gene as antigens, and in its natural sequence on the basis of the codon optimization, cloned into eukaryotic expression vector pCAGGS, constructed DNA pCAGoptiFAV4C vaccine. The avian adenovirus DNA vaccine of the invention adopts the method of gene engineering fermentation to prepare antigen, which has the advantages of low cost, pure antigen and safe use. The immune effect of the vaccine was evaluated by serological method and immune challenge method. The results showed that the vaccine could provide effective immune protection for birds and had a good prospect of commercial development. Compared with the traditional vaccine, the DNA vaccine of the invention has the safety of subunit vaccine and inactivated vaccine, and only has the characteristics of attenuated vaccine or recombinant vaccines have also induced both humoral and cellular immune responses.

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用
本专利技术涉及生物制品
，进步涉及DNA疫苗研发技术，具体涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用。
技术介绍
Ⅰ群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。FAV-4具有明显的致病年龄段，对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播。1987年在巴基斯坦临近卡拉奇的安哥拉首先报道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的几个邦、厄瓜多尔、秘鲁、智利、中南美洲、俄罗斯和孟加拉国等国相继发现该病。如今，世界各地都有HHS的踪影，遍及拉丁美洲、中东和亚洲的一些国家。通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国内尚无疫苗可用，导致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。目前，FAV-4接种鸡胚或原代鸡肾脏细胞肝细胞来接种制备疫苗。鸡胚繁殖病毒毒价低，病毒需要高倍浓缩，成本高昂；而原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作。所以急需新型的疫苗。DNA疫苗的出现，开拓了FAV疫苗研究的新方法。DNA疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，对不同血清亚型毒株具有交叉保护，还具有嵌合免疫、多重免疫及联合免疫等优点。Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形态，毒粒直径为70-90nm，无囊膜，呈球形，二十面体对称结构。病毒粒子具有252个壳粒，240个非顶角壳粒为六邻体，12个顶角壳粒为五邻体，每个五邻体有2条纤维突起。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，以解决现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对Ⅰ群4型禽腺病毒免疫效果不佳的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中抗原物质的免疫原性较低。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对疾病的防疫范围较为局限。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是在其天然表达基因基础上以鸡偏嗜密码子替换其中的鸡稀有密码子所得的产物。作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是序列如SEQIDNo.2所示的DNA。作为优选，所述抗原是通过以下方法制备的：1)分别以SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQIDNo.2所示状态，合成该基因到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-optiFAV4C；3)将重组载体pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoRI和SmaI双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜，将连接产物在宿主细胞中扩增。作为优选，所述将连接产物在宿主细胞中扩增，具体包括以下操作：将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，即得到作为抗原的质粒pCAGoptiFAV4C。作为优选，步骤3)完成后继续执行以下步骤4)：使用商品名为Endofree的质粒大提试剂盒对重组质粒pCAGoptiFAV4C进行提取纯化。同时，本专利技术提供了一种上述疫苗用于预防鸡心包积水肝炎综合征的应用。本专利技术提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，该技术方案基于实验手段研究发现研究表明纤维突起具有良好的免役原型，据此以4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端基因作为抗原物质，并在其天然序列的基础上进行了密码子优化，克隆入真核表达载体pCAGGS中，构建了DNA疫苗pCAGoptiFAV4C。本专利技术研究的禽腺病毒DNA疫苗采用了基因工程发酵的方法制备抗原，成本低，抗原纯净，使用安全。本专利技术制备的Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本专利技术中制备的DNA疫苗对禽能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。与传统疫苗相比，本专利技术的DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。附图说明图1是本专利技术具体实施方式中各组受试鸡免疫后鸡体内在不同时间段的抗体水平图。其中空白对照组为每羽受试鸡肌注0.2ml生理盐水；DNA疫苗组为每羽受试鸡肌注0.2mlDNA疫苗，其中质粒含量为30ug。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例11.1纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析：设计合成一对引物：引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTT3’；引物2：5’AAACTCGAGTTATGTAAAGGGAATGG3’。FAV-4强毒株分离自发病肉鸡。以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体(TaKaRa公司)上，构建pMD-18T-FAV4C；利用双脱氧链终止法进行序列测定，结果显示，从FAV-4基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因如SEQIDNo.1所示。根据鸡偏嗜密码子将基因进行密码子优化，优化后的FAV-4-C基因如SEQIDNo.2所示，合成该基因到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-optiFAV4C。1.2DNA疫苗重组工程菌的构建：将pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoRI和SmaI双酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C‑末端的表达基因。

【技术特征摘要】
1.一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。2.根据权利要求1所述的一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是在其天然表达基因基础上以鸡偏嗜密码子替换其中的鸡稀有密码子所得的产物。3.根据权利要求1所述的一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是序列如SEQIDNo.2所示的DNA。4.根据权利要求1所述的一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于所述抗原是通过以下方法制备的：1)分别以SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQIDNo.2所示状态...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐荣宏，李亚杰，杨保收，付旭彬，梁武，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12