鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，经培养、冻融、离心、浓缩等步骤得到制苗病毒液；2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，经培养，收获鸡胚病毒尿囊液，然后进行离心、浓缩，分别得到鸡新城疫、禽流感H9亚型制苗病毒液；3)将三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。本发明专利技术提供的三联疫苗效价高，对鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保护作用，安全性良好，稳定有效，保护期长。

Preparation method of Newcastle disease, avian influenza virus and avian adenovirus inactivated vaccine

The invention relates to a preparation method of Newcastle disease, avian influenza virus and avian adenovirus inactivated vaccine, which comprises the following steps: 1) avian adenovirus type 4 vaccine inoculated in LMH cells, virus was obtained after incubation, freeze thawing, centrifugation and concentration steps; 2) to Newcastle La disease virus Sota strain and H9 subtype avian influenza virus were inoculated into the allantoic cavity, after cultivation, harvest virus allantoic fluid, and then centrifuged and concentrated, Newcastle disease, were H9 subtype of avian influenza virus vaccine liquid; 3) the seedling virus liquid of three viruses in inactivated, mixing emulsion made of emulsion inactivated vaccine. Triple vaccine provided by the invention is high, the Newcastle disease virus, H9 subtype avian influenza virus and avian adenovirus type 4 has a complete immune protection function, good safety, stable and effective, long term of protection.

【技术实现步骤摘要】
鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
鸡新城疫(ND)俗称鸡瘟，是由鸡新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现仅为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。更重要的是，H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流行，给人类健康带来了严重的威胁。禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。其中，禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。目前针对鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗不断推出，可避免需要多次应用相应的单项灭活疫苗引起的手续繁琐、使用不便、防疫成本较高等问题。如公开号为CN105664150A的中国专利申请“一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗”中所述三联疫苗的制备方法为分别将鸡新城疫、禽流感病毒接种鸡胚收获抗原，将禽腺病毒接种鸡肝细胞收获抗原，然后将各自抗原混合，再进行抗原的浓缩灭活、成品乳化。但所述的禽腺病毒以原代鸡肝细胞进行培养，制备繁琐、易污染、难以到达高效转染，不利于实验操作。因此，有必要提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。本专利技术提供的技术方案为如下：本专利技术提供一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO2培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；(2)将鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。进一步地，上述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：①细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；②禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；③制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液；其中，所述步骤①中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。所述的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。所述步骤②中的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。进一步地，所述步骤②中的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。进一步地，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。其中，上述pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。进一步地，上述三种病毒的制苗病毒液在进行灭活前需进行病毒含量测定，其中，禽腺病毒4型病毒含量测定为：取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变，计算TCID50。鸡新城疫病毒和禽流感H9亚型病毒含量测定为：取浓缩后的病毒液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50。进一步地，将三种病毒的制苗病毒液按等体积混合后，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。进一步地，上述三种病毒的制苗病毒液的灭活采用0.1％福尔马林灭活，灭活时间为12～24小时。其中，禽腺病毒4型病毒灭活检验为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO

【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO2培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；(2)将鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：(1)细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；(2)禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；(3)制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。3.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。4.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。5.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，谢秉超，严悌昆，
申请(专利权)人：广州博恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44