罗汉果高效脱毒的组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，包括：将外植体进行消毒得到无菌外植体；将所得无菌外植体接种至MS诱导培养基中进行诱导培养得到无菌试管苗；将所得无菌试管苗于MS预培养基中进行预培养得到预培养试管苗；将所得的预培养试管苗接种至MS脱毒培养基中进行脱毒培养得到试管丛生芽；选取健壮的试管丛生芽接种至1/2MS生根培养基中进行生根培养得到带根植株，最后将所得的带根植株进行练苗和移栽；其中，所述MS诱导培养基至少包含0.5‑1.0mg/L的金刚烷酮，所述MS预培养基至少包含0.5‑1.0mg/L的金刚烷酮和0.1‑0.6mg/L的硝酸银。本发明专利技术方法得到的罗汉果丛生芽增殖系数达到20‑30倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，生根率可达95％，成活率95％。

Tissue culture method for efficient detoxification of Momordica fruit

The invention discloses a high efficient detoxification of Siraitia grosvenorii tissue culture method, including: the explants were sterilized by sterile explants; the sterile explants were inoculated in MS induction medium were induced and cultured by sterile plantlets; the aseptic Plantlets on MS pre culture medium were pre incubated by pre culture plantlets; the pre cultured plantlets inoculated to MS virus-free culture of virus-free culture tube buds medium; selection of robust test tube shoots were inoculated in 1/2MS medium with root root root, the root plants with scouring seedling and transplanting; among them, King Kong the pyrrolidone MS induced medium containing at least 0.5 1.0mg/L, the MS of pre culture adamantanone based contains at least 0.5 1.0mg/L and 0.1 0.6mg/L silver nitrate. By the method of the present invention S.grosvenorii axillary bud growth coefficient reached 20 30 times, bud strong, inoculated into the rooting medium easily after rooting, the rooting rate was 95%, the survival rate of 95%.

【技术实现步骤摘要】
罗汉果高效脱毒的组织培养方法
本专利技术涉及罗汉果植物繁殖领域，特别是一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法。技术背景罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是我国传统出口创汇商品之一，味甘性凉，有润肺止咳、生津止渴的功效、适用于肺热或肺燥咳嗽、百日咳及暑热伤津口渴等，此外还有润肠通便的功效。是国家首批批准的药食两用材料之一，在广西民间以有300多年的药用历史，被誉为“东方神果”。长期以来，罗汉果在种植过程中主要采用压蔓方式进行繁殖，以致品种退化、病虫危害严重等问题，尤其是病毒病，严重地块其发病率高达100％，造成巨大泾济损失。近年来，罗汉果生产中主要采用组培苗繁殖，但实践表明，市场上销售的组培苗因为大多具有潜伏病毒病，以致大田种植中病毒病暴发，严重影响产量和品质(林纬等,广西罗汉果病毒病发生情况调查.植物保护,2003.29(4):27-30；唐学军与孙桂春,罗汉果病毒病综合治理.广西农学报,2006.21(5):43-44；梁惠凌,蒋水元与李虹,罗汉果组培苗病毒病流行因子的调查.特产研究,2008.30(2):50-52)。申请号为201510290985.0的专利技术专利公开了一种罗汉果组培苗繁育方法，其选取的是健康的罗汉果植株作为繁殖素材，并不是专门针对含有带有病毒的罗汉果植株，其公开的处理方法中只是对繁殖素材进行简单地杀菌处理，虽取得一定效果，但尚需改善提高，并且其利用的培养基成分比较普通，无法在培养中进一步杀毒，真正杜绝病毒病的爆发。因此，设计一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法成为一个亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其中包括：将外植体进行消毒得到无菌外植体；将所得无菌外植体接种至MS诱导培养基中进行诱导培养得到无菌试管苗；将所得无菌试管苗于MS预培养基中进行预培养得到预培养试管苗；将所得的预培养试管苗接种至MS脱毒培养基中进行脱毒培养得到试管丛生芽；选取健壮的试管丛生芽接种至1/2MS生根培养基中进行生根培养得到带根植株，最后将所得的带根植株进行练苗和移栽得到罗汉果幼株；其中，所述MS诱导培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮，所述MS预培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮和0.1-0.6mg/L的硝酸银。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，选取带病毒的罗汉果植株新萌发的嫩芽作为外植体，然后将所得的外植体剥去叶后，依次用体积分数为1-3％的洗洁精水溶液浸泡5min、自来水冲洗15-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升体积分数为0.1-0.2％的升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到所述无菌外植体。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，在接种至MS诱导培养基之前，先将无菌外植体切成带有一个腋芽的茎段。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述MS诱导培养基包含：0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，pH值为5.5-6。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述诱导培养的培养条件为：温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天，培养时间为30天。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述MS预培养基包含：0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、0.1-0.6mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，pH值为5.5-6，预培养的时间为9-11天。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述脱毒培养步骤中，从所述预培养试管苗剥取0.2-0.3mm的茎尖分生组织，将所得的茎尖分生组织接种所述脱毒培养基中，温度为23-27℃的条件下黑暗培养20天，得到所述试管丛生芽。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述脱毒培养基包含：0.2-1.0mg/L的TDZ、0.1-0.5mg/L的ZT、0.1-1.0mg/L的IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，pH值为5.5-6。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述生根培养基包含：0.2-1.0mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；所述生根培养的条件为：温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天，培养时间为20天。优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述练苗和移栽具体包括：将所得的带根植株使用自来水培养一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部，再使用完全培养液培养一个月后移栽到大田即得到罗汉果幼株。完全培养液为常规使用的植物培养液，在市场上可以购得，或是自行配制，只要能将幼苗培养成幼株即可。本专利技术具有以下有益效果：首先本专利技术用生物技术对罗汉果进行组织培养脱毒繁殖，通过罗汉果芽原基脱毒的培养，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的罗汉果幼苗，保障罗汉果种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。其次，采用本专利技术所述的培养方法得到的罗汉果丛生芽增殖系数达到20-30倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，生根率可达95％以上，成活率95％。。再次，本专利技术针对的是带有病毒的罗汉果植株，对其进行杀菌后，利用特别地培养基进行诱导培养和预培养，得到真正无毒的试管苗，然后在利用这样无毒的试管苗进行培养得到丛生芽，再培养得到带根植株，最后进行练苗和移栽得到真正无毒的罗汉果幼株。最后，本专利技术的MS诱导培养基包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮，MS预培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮和0.1-0.6mg/L的硝酸银，能够在培养过程中有效清除组织携带的病毒，得到真正无毒无菌的试管苗。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取罗汉果带病毒的植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去叶后，依次用2％(v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％(v/v)升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的无菌外植体将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀切成带有一个腋芽的茎段，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。(3)试管苗脱毒预培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于液体MS预培养基中，震荡培养10天得到预培养试管苗，其中MS预培养基中添加0.5mg/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，包括：将外植体进行消毒得到无菌外植体；将所得无菌外植体接种至MS诱导培养基中进行诱导培养得到无菌试管苗；将所得无菌试管苗于MS预培养基中进行预培养得到预培养试管苗；将所得的预培养试管苗接种至MS脱毒培养基中进行脱毒培养得到试管丛生芽；选取健壮的试管丛生芽接种至1/2MS生根培养基中进行生根培养得到带根植株，最后将所得的带根植株进行练苗和移栽；其中，所述MS诱导培养基至少包含0.5‑1.0mg/L的金刚烷酮，所述MS预培养基至少包含0.5‑1.0mg/L的金刚烷酮和0.1‑0.6mg/L的硝酸银。

【技术特征摘要】
1.一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，包括：将外植体进行消毒得到无菌外植体；将所得无菌外植体接种至MS诱导培养基中进行诱导培养得到无菌试管苗；将所得无菌试管苗于MS预培养基中进行预培养得到预培养试管苗；将所得的预培养试管苗接种至MS脱毒培养基中进行脱毒培养得到试管丛生芽；选取健壮的试管丛生芽接种至1/2MS生根培养基中进行生根培养得到带根植株，最后将所得的带根植株进行练苗和移栽；其中，所述MS诱导培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮，所述MS预培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮和0.1-0.6mg/L的硝酸银。2.如权利要求1所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，选取带病毒的罗汉果植株新萌发的嫩芽作为外植体，然后将所得的外植体剥去叶后，依次用体积分数为1-3％的洗洁精水溶液浸泡5-6min、自来水冲洗15-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升体积分数为0.1-0.2％的升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到所述无菌外植体。3.如权利要求1所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，在接种至MS诱导培养基之前，先将无菌外植体切成带有一个腋芽的茎段。4.如权利要求1所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，所述MS诱导培养基包含：0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，pH值为5.5-6。5.如权利要求4所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，唐美琼，王晓峰，李竞才，李小勇，周琼，闫志刚，覃芳，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：广西,45