基于量子点的CA15‑3免疫层析试纸条的制备方法技术

本发明专利技术涉及基于量子点的CA 15‑3免疫层析试纸条的制备方法；将量子点(quantum dots QDs)与CA 15‑3抗体偶联制备成荧光探针QDs@Ab1，QDs@Ab1、CA 15‑3和包埋在试纸条的另一种CA 15‑3抗体(Ab1’)通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构QDs@Ab1‑CA 15‑3‑Ab1’，定性半定量地检测乳腺癌的肿瘤标志物CA 15‑3。与现有产品和技术相比，本发明专利技术制备过程简单，适合于产业化生产；抗原浓度与探针荧光强度正相关，可定性定量检测CA 15‑3；整个检测过程，成本低廉且操作非常简便，适合高危人群的社区肿瘤筛选，建立了一种肿瘤检测的新方法。

Based on quantum dots CA15 3 immunochromatographic strip preparation method

The invention relates to a preparation method based on CA quantum dots 15 3 immunochromatographic test strip; quantum dots (quantum dots QDs) and CA 15 3 antibody coupled to prepare fluorescent probe QDs@Ab1, QDs@Ab1, CA 3 and 15 embedded in another CA strip the 15 3 antibody (Ab1) by antigen antibody interactions, forming a similar sandwich structure of QDs@Ab1 CA 15 3 Ab1, qualitative and semi quantitative detection of breast cancer tumor marker CA 15 3. Compared with the existing products and technologies, the preparation process is simple and suitable for industrial production; antigen concentration and fluorescence intensity, qualitative quantitative detection of CA 15 3; the whole detection process, low cost and convenient operation, suitable for the screening of high-risk tumors, a new method was set up detection of tumor.

【技术实现步骤摘要】
基于量子点的CA15-3免疫层析试纸条的制备方法
本专利技术涉及医药诊断
，更具体的是涉及一种新型的基于量子点的CA15-3免疫层析试纸条的制备方法。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升并有年轻化趋势。最新调查显示，乳腺癌已位居全球女性恶性肿瘤死亡率首位，严重威胁女性生命健康安全。女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。因此研究乳腺癌早期诊断方法有重大意义。血清糖类抗原(Carbohydrateantigen，CA)15-3是目前临床上应用最广泛的乳腺癌诊断和病情监测指标，乳腺癌患者通常伴随着该物质的血清含量升高，正常人血清中CA15-3的含量尚不到28U/mL。因此CA15-3血清水平是乳腺癌患者检测的一项关键指标。对乳腺癌的早期诊断，术后监测有重大作用。免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合的一种新型检测技术，它既有免疫标记的特异性又有层析技术快速、便捷等优势。其中胶体金免疫层析试纸条已广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。但胶体金作为标记物，抗原浓度低的样本检测条带颜色太浅无法用肉眼识别，限制了其在检测血清肿瘤标志物的应用。量子点(QDs)是一种半导体纳米晶，它具有宽激发谱、窄发射谱、荧光效率高、光稳定性好等优点，是一种备受关注的新型荧光探针。用量子点取代传统的胶体金作为标记物可以弥补胶体金标记的不足。所以本文拟研制基于量子点的CA15-3免疫荧光试纸条，从而实现对乳腺癌肿瘤标志物进行快速、方便、灵敏检测，建立乳腺癌检测的新方法。
技术实现思路
鉴于肿瘤标志物在肿瘤检测中的重要地位、量子点纳米粒子独特的光学性质以及层析技术简便和价格方面的优势。我们将结合量子点和免疫层析试纸条两种技术，利用量子点羧基和CA15-3单克隆抗体(Ab1)的氨基反应，制得量子点荧光探针QDs@Ab1。探针、CA15-3和包埋在试纸条的另一种CA15-3抗体(Ab1’)通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构QDs@Ab1-CA15-3-Ab1’。对CA15-3——乳腺癌肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立肿瘤标志物检测的新方法，致力于简单迅速、价格低廉、定性定量、操作简便的乳腺癌诊断方法。本专利技术的技术方案如下：基于量子点的CA15-3免疫层析试纸条的制备方法；其步骤如下：(1)将水溶性量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到反应器，然后向反应器中加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到活化的量子点；(2)将活化的量子点、CA15-3单克隆抗体按照摩尔比为1:20～100比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；(3)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗除去游离的抗体和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，得到荧光探针QDs@Ab1，然后将产物分散在含有1～5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，4℃静置过夜；(4)将另一种CA15-3抗体以及羊抗鼠IgG用PBS缓冲液稀释到1～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线；(5)将样品垫，结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序固定于单面塑胶板上，各个垫和膜之间相互重叠1～3mm，完成试纸条的组装。所述量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐质量分数比为1：4000～10000。所述原料摩尔比量子点：CA15-3单克隆抗体＝1：10～100。所述样品垫处理方法如下，样品垫浸入含Tween-200.1％～2％的Tris-HCl缓冲液中静置5-10min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。所述结合垫处理方法如下，结合垫浸入含BSA、亲水聚合物、表面活性剂、蔗糖的PBS缓冲液的处理液中，静置5～10min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。所述处理液配方如下：中BSA浓度为1％～4％，亲水聚合物浓度为0.5％～5％，表面活性剂浓度为0.1％～2％，蔗糖浓度为1％～10％。所述步骤1)中在旋转混合架上活化量子点的羧基30min，离心得到活化的量子点；本专利技术制备的新型基于量子点的CA15-3免疫层析试纸条优势在于：1.采用量子点这种具有优异的光学性质，已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面的纳米材料作为探针荧光来源，将纳米技术应用到肿瘤检测领域。2.采用免疫层析技术作为检测用的基材，免疫层析技术因其简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。3.采用量子点的羧基和抗体的氨基之间的反应形成的牢固的化学键，而非传统的静电吸附作用，提高了试纸条抵抗非特异性吸附的能力，量子点荧光强度和CA15-3浓度之间正相关关系可同时实现定性和定量检测，且灵敏度高，最低可检测出0.16U/mL。附图说明图1：本专利技术制备的基于量子点的CA15-3试纸条阴性样品的检测图片。图2：本专利技术制备的基于量子点的CA15-3试纸条阳性样品的检测图片。图3：实施案例1制备的基于量子点的CA15-3试纸条样品定量检测拟合曲线。图4：实施案例2制备的基于量子点的CA15-3试纸条样品定量检测拟合曲线。图5：实施案例3制备的基于量子点的CA15-3试纸条样品定量检测拟合曲线。具体实施方式下面的实施案例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。具体步骤说明如下：1.量子点偶联CA15-3抗体(QDs@Ab1)(1)将水溶性量子点(QDs)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到反应器，然后向反应器中加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基30min，离心得到活化的量子点。(2)将活化的量子点、CA15-3单克隆抗体Ab1按照摩尔比为1:20～100比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；(3)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去游离的抗体和EDC，得到荧光探针QDs@Ab1，最后将产物分散在含有1～5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜。2.抗体的固定将另一种CA15-3抗体(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS缓冲液稀释到1～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时。3.样品垫、结合物释放垫的预处理以及荧光探针的固化(1)将样品垫浸入含Tween-200.1％～2％的Tris-HCl缓冲液中静置5-10min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。(2)结合垫浸入含BSA、亲水聚合物、表面活性剂、蔗糖的PBS缓冲液的处理液中，静置5～10min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。(3)将所得荧光探针QDs@Ab1用含BSA、亲水聚合物、表面活性剂、蔗糖的PBS缓冲液的处理液稀释5～20倍，均匀涂覆在上述已处理的结合物释放垫上，静置5～10min后于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。4.试纸条本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于量子点的CA 15‑3免疫层析试纸条的制备方法；其特征是步骤如下：(1)将水溶性量子点与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐加入到反应器，然后向反应器中加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到活化的量子点；(2)将活化的量子点、CA 15‑3单克隆抗体按照摩尔比为1:20～100比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；(3)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗除去游离的抗体和1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，得到荧光探针QDs@Ab1，然后将产物分散在含有1～5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，4℃静置过夜；(4)将另一种CA 15‑3抗体以及羊抗鼠IgG用PBS缓冲液稀释到1～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线；(5)将样品垫，结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序固定于单面塑胶板上，各个垫和膜之间相互重叠1～3mm，完成试纸条的组装。

【技术特征摘要】
1.基于量子点的CA15-3免疫层析试纸条的制备方法；其特征是步骤如下：(1)将水溶性量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到反应器，然后向反应器中加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到活化的量子点；(2)将活化的量子点、CA15-3单克隆抗体按照摩尔比为1:20～100比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；(3)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗除去游离的抗体和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，得到荧光探针QDs@Ab1，然后将产物分散在含有1～5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，4℃静置过夜；(4)将另一种CA15-3抗体以及羊抗鼠IgG用PBS缓冲液稀释到1～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线；(5)将样品垫，结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序固定于单面塑胶板上，各个垫和膜之间相互重叠1～3mm，完成试纸条的组装。2.如权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，张健，姚颖异，宫晓群，武玉东，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12