一种选择性富集和鉴定N-连接糖肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于氨基和醛基的还原胺化反应的选择性富集和鉴定生物样品中N-糖基化位点的方法及其在N-糖蛋白质组分析中的应用。首先，取含糖蛋白的生物样品一份，用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用甲醛封闭肽段的末端氨基和侧链氨基，然后用高碘酸钠溶液氧化糖肽上的糖链生成醛基，之后利用氨基微球富集氧化后的糖肽并用肽糖苷酶PNGase F处理，最后对释放的N-糖肽进行质谱分析，以得到样品中的N-糖蛋白质组信息。本方法可用于糖基化蛋白质组学分析，能同时获取相应的糖蛋白、糖肽和糖基化位点的鉴定结果。本方法对于鉴定糖蛋白上N-糖基化位点简便，高效，高通量。

A method for selective enrichment and identification of N- linked glycopeptides

The present invention relates to selective enrichment and identification of N- glycosylation sites in biological samples based on reductive amination of amino and aldehyde groups and its use in N- sugar proteome analysis. First of all, from a biological sample containing glycoprotein, with trypsin enzyme Trypsin, and closed with formaldehyde and side chain amino terminal amino peptide, and then use the sugar chain generated aldehyde sodium periodate oxidation solution on the use of glycopeptides, after enrichment of amino microspheres after oxidation treatment with F and glycopeptide peptide glycosidase PNGase, at the end of the release of the N- peptide by using mass spectrometry to obtain N- glycoproteomie information in the sample. The method can be used for glycosylated proteomics analysis, and can simultaneously obtain the identification results of corresponding glycoproteins, glycopeptides and glycosylated sites. This method is simple, efficient and high-throughput for the identification of N- glycosylation sites on glycoproteins.

【技术实现步骤摘要】
一种选择性富集和鉴定N-连接糖肽的方法
本专利技术属于蛋白质组学研究方向糖基化蛋白质组学
，具体涉及基于氨基化学的选择性富集N-连糖肽的方法及其应用。
技术介绍
在真核生物中，蛋白质糖基化作为一种最普遍且最重要的翻译后修饰，参与了细胞凋亡，免疫应答，细胞-细胞相互作用，配体-受体相互作用以及疾病的发生发展等生命过程。目前，临床上所用的疾病标志物大多是糖基化蛋白质，如肝癌的标志蛋白-甲胎蛋白(AFP)，恶性肿瘤的标志物-癌症抗原125(cancerantigen125)，以及前列腺癌的标志物—前列腺癌特异抗原(PSA)等等。因此，对于糖蛋白的全面深入研究具有非常重要的意义。在糖基化蛋白质组分析中，高效液相色谱-质谱联用是大规模分析糖蛋白或者糖肽的一种有效平台。当生物样品直接进行质谱分析时，由于相对于非糖肽或非糖蛋白而言，糖肽或糖蛋白的含量很低，并且糖肽或糖蛋白的离子信号强度往往会被非糖肽或糖蛋白的离子信号所抑制，因而在进行蛋白质糖基化分析时，对糖肽或糖蛋白进行预分离和富集是很有必要的。目前，主要有三类方法用于富集糖肽或糖蛋白，包括凝集素亲和色谱法(文献1.Kaji,H.etal.Nat.Biotechnol.2003,21,667-672；文献2.Kim,J.Y.etal.Anal.Chem.2014,86,7650-7657.)，亲水作用色谱法(文献3.Chen,R.etal.J.Proteomics2014,103,194-203；文献4.ZhuJ.etal.Anal.Chem.2012,84,5146-5153.)，以及通过糖链与材料的功能基团共价链接的化学方法(文献5.Zhang,H.etal,Nat.Biotechnol.2003,21,660-666；文献6.Xu,Y.W.etal.Anal.Chem.2009,81,503-508.)。与色谱方法相比，化学方法的明显优势是其高特异性(文献7.Sun,B.Y.etal.J.ProteomeRes.2014,13,2705-2714.)。酰肼化学法是富集糖肽或糖蛋白较为有效的化学方法，该方法的主要原理是用高碘酸钠氧化糖链上的顺式邻二醇生成醛，然后与固定在材料上的肼共价结合，从而达到分离富集糖肽或糖蛋白的效果。但是商品化的酰肼琼脂糖微球在溶液体系中难分散且难分离，价格也较昂贵(文献8.Zhang,Y.etal.Anal.Chem.2013,85,5535-5541.)。在本专利技术中，我们利用较廉价的氨基微球富集糖肽。伯胺和醛基之间的还原氨化反应已经在蛋白质和多肽的分析中广泛应用，如在定量蛋白质组学中广泛使用的二甲基标记反应(文献9.Boersema,P.J.etal.Nat.Protoc.2009,4,484-494.)和蛋白质的固定化反应(文献10.Lee,C.H.etal.NanoToday2009,4,165-179.)。其原理是，氨基和醛基之间形成席夫碱并被还原试剂如氰基硼氢化钠还原成稳定的仲胺或叔胺。因此，像酰肼化学法一样，也可以用氨基微球去富集分离高碘酸钠氧化后的糖肽，我们称之为氨基化学法。但是，氨基化学法存在一个比较显著的问题，即样品中肽段的末端氨基和侧链氨基也能与氧化后的糖链上的醛基形成席夫碱，并被加入的还原试剂还原，这就对氨基微球富集糖肽造成较大的干扰(图1中的插图)，大大降低了氨基化学法的效率。在本专利技术中，我们在用高碘酸钠氧化糖链之前，首先利用甲醛封闭肽段上的伯胺基团，糖链氧化后生成的醛基就可以最大限度的与微球上的氨基反应，从而大大提高了氨基化学法富集糖肽的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以简便、高效、高通量分析复杂生物样品中N-糖蛋白质组信息的方法。本专利技术提供的方法是基于肽段上的伯胺基团可以与甲醛发生还原氨化反应，以及微球上的氨基可以与高碘酸钠氧化后的糖链上的醛基发生还原氨化反应，从而将糖肽从复杂样品中富集分离出来，然后通过质谱分析得到样品的糖蛋白质组信息。该方法可以总的表述为，基于两次还原氨化反应的氨基化学法用于高通量分析样品中的N-糖蛋白质组信息；与此相对应，肽段上伯胺基团不被封闭的氨基化学法可以称之为基于一次还原氨化反应的氨基化学法。本专利技术采用如下技术方案：首先，取生物样品，用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用甲醛封闭肽段的末端氨基和侧链氨基，然后用高碘酸钠溶液氧化糖肽上的糖链生成醛基，之后利用氨基微球富集氧化后的糖肽并用肽糖苷酶PNGaseF处理，最后对释放的N-糖肽进行质谱分析，以得到样品中的N-糖基化位点，N-糖肽，及对应的糖蛋白信息。具体包含以下步骤，1)取生物样品，溶解在含6-8MUrea和50-100mMTEAB的缓冲溶液中，加入终浓度为10-20mMDTT，37-60℃水浴中1-2h，然后加入终浓度为20-40mMIAA，20-25℃避光反应40-60min；生物样品在缓冲溶液的浓度为1-10mg/mL；2)步骤1)结束后得到的样品，用含50-100mMTEAB的水溶液按将Urea浓度稀释至0.5-1M的比例稀释，然后加入与全蛋白质量比为1/50-1/25的胰蛋白酶Trypsin，37℃水浴中酶解12-16h，得到肽段溶液；3)向步骤2)结束后得到的肽段溶液依次加入与肽段质量比为1/100-1/200的4-8wt％CH2O/H2O和与肽段质量比为5/1-10/1的新鲜配制的0.6-1.2MNaBH3CN水溶液，25℃反应1-2h；4)向步骤3)得到的肽段溶液中加入与体系总体积的体积比为1/50-1/100的8-16wt％氨水，再加入甲酸调pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥；5)将步骤4)得到的肽段溶解在含10-15mM高碘酸钠(氧化剂)、80-100mMNaAC和130-150mMNaCl的缓冲溶液中，使肽段在溶液中的浓度为0.5-1mg/mL。20-25℃避光氧化1-1.5h。然后加入Na2S2O3以终止氧化，使Na2S2O3在体系中的终浓度为20-30mM。20-25℃反应15-30min；6)取氨基微球(SiO2@NH2)，以含80-100mMNaAC和130-150mMNaCl的缓冲溶液洗离2-3次，然后加入步骤5)得到的肽段溶液中，加入的氨基微球自身体积与溶液的体积比为1∶5-1∶6，20-25℃震荡10-20min后，再加入NaBH3CN至NaBH3CN在体系中的终浓度为0.1-0.2M，然后置于20-25℃摇床内富集10-12h；7)步骤6)得到的产物以14000-15000g离心3-5min，弃去上清液。得到的氨基微球依次以1.0-1.5MNaCl溶液、80-90％ACN/H2O(v/v)、50-100mMNH4HCO3溶液和水各洗离3-4次，以洗去非特异性吸附的肽段，并分散在10-20mM的TEAB缓冲溶液中，氨基微球自身所占体积与TEAB溶液的体积比为1∶4-1∶5，再加入与肽段质量比为500Unites/mg-1000Unites/mg的PNGaseF，,然后置于37℃摇床内酶切10-12h；8)步骤7)得到的混合液以14000-15000g离心3-5min，取上清，即得到富集的N-糖肽样品，然后直接以M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性富集和鉴定N‑连接糖肽的方法，其特征在于：首先，取生物样品，用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用甲醛封闭肽段的末端氨基和侧链氨基，然后用高碘酸钠溶液氧化糖肽上的糖链生成醛基，之后利用氨基微球富集氧化后的糖肽并用肽糖苷酶PNGase F处理，最后对释放的N‑糖肽进行质谱分析，以得到样品中的N‑糖基化位点，N‑糖肽，及对应的糖蛋白信息。

【技术特征摘要】
1.一种选择性富集和鉴定N-连接糖肽的方法，其特征在于：首先，取生物样品，用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用甲醛封闭肽段的末端氨基和侧链氨基，然后用高碘酸钠溶液氧化糖肽上的糖链生成醛基，之后利用氨基微球富集氧化后的糖肽并用肽糖苷酶PNGaseF处理，最后对释放的N-糖肽进行质谱分析，以得到样品中的N-糖基化位点，N-糖肽，及对应的糖蛋白信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包含以下步骤，1)取生物样品，溶解在含6-8MUrea和50-100mMTEAB的缓冲溶液中，加入终浓度为10-20mMDTT，37-60℃水浴中1-2h，然后加入终浓度为20-40mMIAA，20-25℃避光反应40-60min；生物样品在缓冲溶液的浓度为1-10mg/mL；2)步骤1)结束后得到的样品，用含50-100mMTEAB的水溶液按将Urea浓度稀释至0.5-1M的比例稀释，然后加入与全蛋白质量比为1/50-1/25的胰蛋白酶Trypsin，37℃水浴中酶解12-16h，得到肽段溶液；3)向步骤2)结束后得到的肽段溶液依次加入与肽段质量比为1/100-1/200的4-8wt％CH2O/H2O和与肽段质量比为5/1-10/1的新鲜配制的0.6-1.2MNaBH3CN水溶液，25℃反应1-2h；4)向步骤3)得到的肽段溶液中加入与体系总体积的体积比为1/50-1/100的8-16wt％氨水，再加入甲酸调pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥；5)将步骤4)得到的肽段溶解在含10-15mM高碘酸钠(氧化剂)、80-100mMNaAC和130-150mMNaCl的缓冲溶液中，使肽段在溶液中的浓度为0.5-1mg/mL；20-25℃避光氧化1-1.5h；然后加入Na2S2O3以终止氧化，使Na2S2O3在体系中的终浓度为20-30mM；20-25℃反应15-30min；6)取氨基微球(SiO2@NH2)，以含80-100mMNaAC和130-150mMNaCl的缓冲溶液洗离2-3次，然后加入步骤5)得到的肽段溶液中，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹汉法，张章，叶明亮，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21