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通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用技术

技术编号:15446571 阅读:40 留言:0更新日期:2017-05-29 17:58
本发明专利技术公开了一种通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物及其其合成方法,也公开了透明质酸结合物在制备可注射原位水凝胶的应用,还公开了可注射原位形成的水凝胶在培养胰岛细胞和胰岛素分泌的应用。本发明专利技术通过冷冻干燥和硫醇‑烯点击化学,得到一系列不同修饰率具有稳定醚键的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,其具有巯基活性基团,可进一步功能化修饰;不同修饰率的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过氧酯介导自然化学连接反应得到可注射原位形成的水凝胶,具有良好的流变学性质,其中游离的巯基能增加透明质酸的细胞黏附性,可作为细胞支架材料在胰岛细胞培养及刺激胰岛素分泌应用,具有广阔的生物医药前景。

Cysteine by freeze-drying with thiol ene click chemical preparation of hyaluronic acid binding compound and synthesis method and application thereof

The invention discloses a through freeze drying and thiol ene click chemical preparation of cysteine functionalized hyaluronic acid binding material and its synthesis method, also discloses hyaluronic acid conjugates can be used in the preparation of in situ hydrogel injection, injectable in situ formed hydrogel in islet cell insulin secretion and application training the public. The present invention by freeze drying and thiol ene click chemistry, a series of different modification rate with stable ether bond cysteine functionalized hyaluronic acid conjugates, the thiol reactive groups, which can be further functionalized; different rate of modification of hyaluronic acid conjugates with polyethylene glycol conjugates obtained by the reaction of injectable in situ forming connection the hydrogel by ester mediated natural chemistry, has good rheological properties, the free thiol can increase cell adhesion of hyaluronic acid, can be used as cell scaffold in islet cell culture and stimulated insulin secretion, biological medicine has broad prospects.

【技术实现步骤摘要】
通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用
本专利技术涉及一种冷冻干燥与硫醇-烯点击修饰形成的半胱氨酸功能化透明质酸结合物及其合成方法,以及其制备可注射原位形成水凝胶的应用,属于生物医药领域。
技术介绍
生物支架材料是组织工程和再生医学研究的关键。因为,支架材料不仅为细胞提供结构支撑作用,而且还起到模板作用,用于引导组织再生和控制组织结构。其中,水凝胶类的生物支架在组织工程和再生医学应用中尤为广泛。水凝胶是亲水的聚合物网络,能够吸收大量的水分,具有良好的生物相容性。虽然水凝胶在生物医药中的应用取得了巨大的进展,然而,发展满足临床需要:在温和条件下不使用有毒试剂可注射原位形成的共价交联的水凝胶仍然面临着挑战。大部分水凝胶在组织工程方面的应用的主要缺陷就是需要外科手术介导,手术过程的复杂繁琐无疑给患者带来很大的痛苦和风险。因此,可注射水凝胶的研究引起人们注意,其具有显著的优势:水凝胶在体内原位形成,不经过外科手术而通过针管注射,以最小程度地对机体组织侵入,不仅起到治疗作用,而且还可以与各种生长因子、药物混合填充组织任意形状的缺损,达到更好的治疗效果,这样就可避免外科手术过程中的高度创伤性,特别当用于修复复杂形状的组织时,可注射水凝胶具有自适应性。硫醇-烯点击化学的合成机理主要是指硫醇-烯自由基加成(见附图1)(KadeMJ,BurkeDJ,HawkerCJ.Thepowerofthiol-enechemistry[J].JournalofPolymerSciencePartAPolymerChemistry,2010,48(4):743-750.)。在烯存在的条件下,通过热或者光的引发下使含巯基的分子氢脱去从而获得含硫的自由基,该自由基和碳碳双键(C=C)通过反马氏(anti-Markovnikov)加成形成以碳为中心的活性自由基,与另一含巯基的分子发生链转移反应得到加成产物和另一活性自由基。因此,利用硫醇-烯点击化学反应具有简单、高效、可靠、选择性的C-S成键、特别是可在水溶液中进行的优点修饰多糖类化合物具有显著的优越性。氧酯介导自然化学连接(oxo-estermediatednativechemicalligation,OMNCL)是自然化学连接(nativechemicalligation)概念的扩展。人们发现,酯类化合物和N-末端半光氨酸的化合物在生理条件下(磷酸盐缓冲溶液,pH7-9)混合后,半胱氨酸的巯基和酯类化合物的醇发生交换,形成一个五圆环的中间体后自发地重排,产生一个新的酰胺键。这个化学反应称之为氧酯介导自然化学连(oxo-estermediatednativechemicalligation,OMNCL,见附图2)。OMNCL有几个明显的优点:①具有化学选择性,酯类只与半胱氨酸、或N-末端半胱氨酸的化合物反应形成新的酰胺键,不受其他硫醇和巯基存在的干扰;②在温和的条件下,不使用催化剂、引发剂等可能有毒的化合物而高效反应;③与其它使用巯基的化学连接反应形成的水凝胶不同,自然化学连接反应在形成新的酰胺键的同时,还在骨架上产生一个巯基基团。这个巯基不仅可以根据不同目的用来进一步在骨架上功能化水凝胶,而且,巯基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性。④另外,酯类结构中的醇在OMNCL反应时释放到溶液中,那么,在设计酯的时候,有可能把这个醇设计为羟基化的药物和细胞生长因子的前体,从而在水凝胶形成的同时,释放这些药物和生长因子到水凝胶中。因此,利用OMNCL反应的特点和优点得到的可注射原位形成的共价交联的水凝胶具有显著的优越性。例如:已有文献以聚乙二醇为主体,末端酯或半胱氨酸功能化,通过氧酯介导自然化学连接反应得到聚乙二醇水凝胶(StrehinI,GourevitchD,ZhangY,etal.HydrogelsFormedbyOxo-esterMediatedNativeChemicalLigation.[J].BiomaterialsScience,2013,1(6):603-613.)。透明质酸(hyaluronicacid,HA)广泛分布于动物的各种组织中,由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖重复单位组成,被应用于组织工程与再生医学中(AllisonDD,GrandeallenKJ.Review.Hyaluronan:apowerfultissueengineeringtool.[J]TissueEngineering,2006,12(8):2131-40.)。例如20世纪80年代中期HA已被应用于医学美容创伤敷料以及作为关节炎治疗药上市在细胞外基质中,透明质酸是细胞表面受体CD44的配体,而CD44受体参与多种细胞过程,比如细胞黏附、细胞迁移和增值。由于其重要的生理作用,机体或创面直接注射透明质酸后可明显减轻并消除组织的炎症反应,促进创面与伤口愈合。但是,由于透明质酸在体内被透明质酸酶快速地清除,体内停留时间短、机械强度低等不足,这样的缓解作用也是短暂的,所以透明质酸共价改性形成可注射原位共价交联的透明质酸水凝胶就显示出了它的优越性。透明质酸主要化学修饰靶点包括:D-葡萄糖醛酸的羧基、N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基、以及N-乙酰-D-葡萄糖胺的N-乙酰基。目前临床使用的HA衍生物多为对其羧酸和羟基修饰而成,通过酯化(Esterification)、酰胺化(Amidation)、开环(RingOpening)、交联(Cross-linking)、接枝(Graft)等各种化学改性方法,制备出功能化HA衍生物。其中对透明质酸的羧基修饰的研究比较多,例如有文献通过己二酸二酸腆修饰,并且加入EDC与HOBt作为耦合剂与催化剂,修饰透明质酸的羧基,得到透明质酸结合物,再通过交联形成透明质酸水凝胶(YeoY,HighleyCB,BellasE,etal.Insitu,cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel[J].Biomaterials,2006,27(27):4698-705.)。也有通过与透明质酸的羟基反应形成水凝胶的交联化学反应,比如Seidlits分别采用甲基丙烯酸酐和4-戊烯酸酐对透明质酸C-6位伯醇羟基进行酯化修饰,最后在紫外光照条件下发生交联反应,得到水凝胶(SeidlitsSK,KhaingZZ,PetersenRR,etal.TheEffectsofHyaluronicAcidHydrogelswithTunableMechanicalPropertiesonNeuralProgenitorCellDifferentiation[J].Biomaterials,2010,31(14):3930-3940.)。还有先用半胱氨酸改性缩水甘油醚和透明质酸的羟基反应,再进行自然化学反应形成水凝胶(ZhangX,SunP,HuangshanL,etal.Improvedmethodforsynthesisofcysteinemodifiedhyaluronicacidforin-situhydrog本文档来自技高网...
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【技术保护点】
一种通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,其特征在于:结构式为:

【技术特征摘要】
1.一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,其特征在于:结构式为:式中n=200-4000。2.权利要求1所述一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:1)取结构式为的化合物1透明质酸与结构式为的化合物2,通过冷冻干燥的方法形成结构式为的化合物3;2)取结构式为的化合物4和结构式为的化合物5形成结构式为的化合物6;3)化合物6与二硫键还原剂发生还原反应形成结构式为的化合物7;4)取化合物3与化合物7,在光引化剂和紫外光照射下发生硫醇-烯点击化学形成结构式为的化合物8;5)分别脱去化合物8上的叔丁氧羰基和乙酰氨甲基保护基,得到结构式为的化合物9,即透明质酸结合物产物。3.根据权利要求2所述的一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的制备方法,其特征在于:步骤1)中,化合物1透明质酸的分子量为8~160万。4.根据权利要求2所述的一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的制备方法,其特征在于:步骤1)中,化合物3其修饰率范围为4.03~64.11%;步骤4)中,化合物8其修饰率的范围为2.33~45.67%。5.权利要求1所述的一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱...

【专利技术属性】
技术研发人员:张响胡碧煌李雨欣
申请(专利权)人:海南大学
类型:发明
国别省市:海南,46

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