随机测定含EPA链化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种随机测定含EPA链化合物的方法，包括以下步骤：1)、样品前处理：将鲫鱼肌肉组织进行前处理，得脂质粗提物；2)、进样：脂质粗提物用有机溶剂定容、过滤、使用针泵注射器注射进质谱；3)、质谱检测：使用负离子模式，根据特征子离子寻找所有含有该子离子的母离子，使用Analyst软件采集数据；4)、数据分析：将步骤3)质谱检测所得谱图进行分析，得各个离子峰的结构信息。采用本发明专利技术能随机非定向获知样品中所有含有EPA脂肪酸链的化合物。

A method for the random determination of EPA chain compounds

The invention discloses a method for the determination of the content of EPA random chain compound, which comprises the following steps: 1), sample pretreatment: carp muscle tissue before treatment, lipid extracts; 2) and sample: lipid extracts by organic solvent sizing, filtering, using a needle syringe injection pump in 3), mass spectrometry; mass spectrometry using negative ion mode, according to the characteristics of ions for all sub ions containing the parent ion, the use of Analyst software to collect data; 4), data analysis: Step 3) mass spectrometric detection of the spectra were analyzed from each sub peak information structure. The present invention is capable of random non directional knowledge of all compounds containing EPA fatty acid chains in a sample.

【技术实现步骤摘要】
随机测定含EPA链化合物的方法
本专利技术属于仪器分析领域，涉及一种随机测定含EPA链化合物的方法，具体指一种从复杂样品中无目标性随机扫描含有EPA脂肪酸链的化合物的检测分析方法。
技术介绍
EPA(EicosapentaenoicAcid)，即二十碳五烯酸，是鱼油的主要成分。EPA属于Ω-3系列多不饱和脂肪酸，即从甲基端数第一个双键的位置在第三碳位的多不饱和脂肪酸。EPA是人体不可缺少但自身又不能合成的重要营养元素，因此被称为人体必需脂肪酸。虽然亚麻酸在人体内可以转化为EPA，但此反应在人体中的速度很慢且转化量很少，远远不能满足人体对EPA的需要，因此必须从食物中直接补充。医学和营养学研究表明EPA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒张血管、调整血脂等治疗和预防心脑血管病的功能，EPA过氧化物和自由基可抑制肿瘤细胞表达，缩短染色体的端粒，促进肿瘤细胞的凋亡。EPA能减少有害的免疫反应，并对治疗由自身免疫缺陷引起的炎症有效。Ω-3脂肪酸，包括EPA在内，对肺病、肾病、2型糖尿病、大肠溃疡和节段性回肠炎的治疗都会起到积极的作用。近来又发现其还具有促进脑细胞生长、发育，改善大脑机能，提高记忆力和学习能力，增强视网膜反射能力以及防治老年性痴呆等提高生命质量的功能。因而，提取分离高纯度EPA已成为发达国家竟相研究的热点。商业上EPA的来源主要是脂肪含量高的海洋鱼类，其EPA的质量分数可达到20％～30％。随着海况的变化和海上捕捞强度的不断增加，海上渔业资源结构发生了重大变化，环境污染、过度捕捞等因素造成资源短缺，促使人们积极寻找开发富含EPA的新资源。目前EPA的相关检测方法主要以气相色谱质谱联用法为主，该方法主要检测游离EPA及甲酯化或乙酯化EPA。含EPA链化合物的检测方法主要为液相色谱质谱联用法。目前报道的方法均为定向筛选法，即已知化合物A具有EPA链，根据A的化学或物理特征从样品中定向筛选化合物A。而随机非定向筛选法未有报道。建立随机测定含EPA链化合物的方法，快速扫描复杂样品中含有EPA脂肪酸链的化合物并进行结构鉴定和含量测定，有利于快速筛选EPA原料资源，促进EPA保健品产业发展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便的复杂基质中随机测定含EPA链化合物的方法检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种随机测定含EPA链化合物的方法，包括以下步骤：1)、样品前处理：将鲫鱼肌肉组织洗净后研磨成糜，在糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡提取，提取完毕后加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液干燥(用氮气进行低温吹干)，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：2体积比的混合液或者为甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的混合液，糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5体积倍；2)、进样：将脂质粗提物用甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的有机溶剂定容至100mL作为样品；移取1mL样品过0.22μm滤膜后作为待测样液，使用针泵注射器注射进质谱；3)、质谱检测：使用负离子模式，根据特征子离子寻找所有含有该子离子的母离子，扫描范围为400-1000Da，驻留时间为2秒，气帘气为10psi，加速电压为-4500ev，辅助气Ⅰ为20psi，辅助气Ⅱ为30psi，图谱累加100～200次；使用Analyst软件采集数据；4)、数据分析：将步骤3)质谱检测所得谱图进行分析，得各个离子峰的结构信息。即，得知样品中含有EPA链的化合物的种类和数量。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的改进：所述步骤4)为：将步骤3)质谱检测所得谱图经过噪音过滤(最低峰宽为0.2Da)，基线扣除4Da，去同位素峰后，得到处理后谱图；将处理后谱图导出为txt文件后使用LipidMassSpec.Prediction软件鉴定即可得到各个离子峰的结构信息。备注说明：以PE18:1/20:5为例，结构包括3部分信息，PE指的是磷脂酰乙醇胺类，18:1指的是其中一条脂肪酸链是18碳1双键，20:5指另一条链。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的进一步改进：所述步骤4)还包括：各个母离子浓度经公式：计算，其中Abundancei为化合物丰度，Ai为谱图(步骤3)质谱检测所得谱图)中该特定离子峰的峰面积，A1～An为谱图中所得的所有离子峰的峰面积。利用上述公式能得知样品中含EPA链化合物的大概含量。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的进一步改进：所述步骤1)中，以移取下相溶液后的离心所得物(即，包括上相溶液和固体)替代水产品组织，以机溶剂Ⅰ中的二氯甲烷或者氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；将所有提取后所得的下相溶液合并后进行后续的干燥和复溶。备注说明：离心后离心管内溶液上下分层，三文鱼肌肉组织样品则呈饼状居于两相中间。甲醇、氯仿、水三者在一起的时候不会混溶，会分成上下两相，甲醇极性较强会与水混溶，因此在离心管中，二氯甲烷或者氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相后，实际大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重复提取的时候只需要加入二氯甲烷或者氯仿即可。即，重复提取时二氯甲烷或者氯仿的体积用量＝机溶剂Ⅰ中的二氯甲烷或者氯仿的体积用量。二氯甲烷和氯仿提取效率相近，二氯甲烷毒性弱于氯仿。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的进一步改进：所述步骤1)中，用冷冻离心机离心为：于4℃、8000～12000rpm离心5～15分钟。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的进一步改进：所述步骤2)中，针泵注射器流速为10～20μL/min。作为本专利技术的随机测定含EPA链化合物的方法的进一步改进：所述步骤3)中，所采用的扫描方法为子找母扫描(Precursorionscan)，特征子离子为m/z301，去簇电压为-80～-100ev，碰撞电压为-30～-40ev。综上所述，本专利技术采用m/z301为特征子离子通过负离子模式下子找母扫描方法扫描复杂基质样品中含有EPA链化合物，经谱图处理与数据分析后，随机非定向得到所有含有EPA脂肪酸链的化合物。本专利技术样品前处理、进样、质谱检测、数据分析步骤，操作简便、简单易培训、定性定量能力较强、实用性强，适合实验室广泛使用。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为负离子模式下子找母扫描方法扫描鲫鱼组织样品质谱图。具体实施方式以下结合附图详细说明本专利技术的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本专利技术。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本专利技术，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本专利技术的范围。实施例1、一种随机测定含EPA链化合物的方法，依次进行以下步骤：1)、样品前处理：将100g鲫鱼肌肉组织洗净后研磨成糜，取1g肉糜并加入有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比)21mL后震荡提取，提取完毕后加入纯水10.5mL并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，于4℃、12000rpm离心5分钟。移取下相溶液，向剩余上相及固形物中加入14mL二氯甲烷，重复提取2次；将所有提取后所得的下相溶液合并、干燥后(用氮气进行低温吹干)，得脂质粗提物；2)、进样：将脂质粗提物用甲醇：二氯甲烷本文档来自技高网...

【技术保护点】
随机测定含EPA链化合物的方法，其特征是包括以下步骤：1)、样品前处理：将鲫鱼肌肉组织洗净后研磨成糜，在糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡提取，提取完毕后加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液干燥，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：2体积比的混合液或者为甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的混合液，糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5体积倍；2)、进样：将脂质粗提物用甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的有机溶剂定容至100mL作为样品；移取1mL样品过0.22μm滤膜后作为待测样液，使用针泵注射器注射进质谱；3)、质谱检测：使用负离子模式，根据特征子离子寻找所有含有该子离子的母离子，扫描范围为400‑1000Da，驻留时间为2秒，气帘气为10psi，加速电压为‑4500ev，辅助气Ⅰ为20psi，辅助气Ⅱ为30psi，图谱累加100～200次；使用Analyst软件采集数据；4)、数据分析：将步骤3)质谱检测所得谱图进行分析，得各个离子峰的结构信息。

【技术特征摘要】
1.随机测定含EPA链化合物的方法，其特征是包括以下步骤：1)、样品前处理：将鲫鱼肌肉组织洗净后研磨成糜，在糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡提取，提取完毕后加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液干燥，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：2体积比的混合液或者为甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的混合液，糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5体积倍；2)、进样：将脂质粗提物用甲醇：二氯甲烷＝1：2体积比的有机溶剂定容至100mL作为样品；移取1mL样品过0.22μm滤膜后作为待测样液，使用针泵注射器注射进质谱；3)、质谱检测：使用负离子模式，根据特征子离子寻找所有含有该子离子的母离子，扫描范围为400-1000Da，驻留时间为2秒，气帘气为10psi，加速电压为-4500ev，辅助气Ⅰ为20psi，辅助气Ⅱ为30psi，图谱累加100～200次；使用Analyst软件采集数据；4)、数据分析：将步骤3)质谱检测所得谱图进行分析，得各个离子峰的结构信息。2.根据权利要求1所述的随机测定含EPA链化合物的方法，其特征是：所述步骤4)为：将步骤3)质谱检测所得谱图经过噪音过滤，基线扣除4Da，去同位素峰后，得到处...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈清，崔益玮，戴志远，陈康，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33