一种赭曲霉毒素A快速检测方法技术

本发明专利技术提供了一种赭曲霉毒素A快速检测方法，包括如下的步骤：在微孔硅纳米材料中负载大量的亚甲基蓝分子；用赭曲霉毒素A的核酸适配体封闭负载了亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料；加入赭曲霉毒素A样品后，由于其与核酸适配体间发生特异性结合，核酸适配体从微孔硅纳米材料表面脱落，亚甲基蓝分子得以释放。借助丝网印刷电极和便携式电化学检测仪检测上清液中亚甲基蓝的电信号，得出其与赭曲霉毒素A浓度之间的关系曲线，从而实现赭曲霉毒素A的间接定量检测。在此基础上，引入酶的信号放大作用。核酸酶加入后选择性破坏赭曲霉毒素A和核酸适配体间形成的G‑四联体结构，赭曲霉毒素A又以游离状态回到溶液中，再次重复上述过程。如此往复可以大大提高检测的灵敏度。本方法中的传感器构建过程和检测过程不需要昂贵的仪器和试剂，操作简单，灵敏度很高。

A rapid method for ochratoxin A detection

The present invention provides a method for rapid detection of ochratoxin A, which comprises the following steps: using methylene blue molecules in microporous silicon nano materials; ochratoxin A nucleic acid aptamer closed load microporous silicon nano materials with methylene blue molecules; ochratoxin A samples, with the between the aptamers specific binding aptamer shed from the surface porous silicon nano materials, methylene blue molecules are released. The electrical signals of methylene blue screen printed electrodes and portable electrochemical detector in the supernatant was obtained and ochratoxin A concentration curve, so as to realize the indirect quantitative detection of ochratoxin A. On this basis, the signal amplification of enzyme was introduced. After adding the G nuclease to selectively destroy four conjoined structure of ochratoxin A and nucleic acid aptamers formed between the ochratoxin A and the free state back to the solution, repeat the process again. The sensitivity of the detection can be greatly improved by such reciprocation. In the method, the sensor construction process and the detection process do not need expensive instruments and reagents, and the operation is simple and the sensitivity is high.

【技术实现步骤摘要】
一种赭曲霉毒素A快速检测方法
本专利技术涉及一种赭曲霉毒素A快速检测方法，具体涉及一种基于微孔硅纳米材料、核酸酶循环信号放大和丝网印刷电极的赭曲霉毒素A快速检测方法。
技术介绍
赭曲霉毒素(ochratoxins)是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物，依其发现顺序分别称为赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)。它是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是OTA。它是一种无色结晶化合物，可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水，有很高的化学稳定性和热稳定性。这种毒素是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。被动物摄入后，这种毒素主要侵害动物肝脏与肾脏、引起肾脏损伤；大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死，甚至可能产生致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。残留在动物体内的OTA通过食物链进入人体后，其在人体内的代谢非常慢，半衰期长达30多天，对人类健康会产生很大的危害作用。因此，多个国家制定了相关的卫生标准。例如，瑞士规定猪和禽配合饲料中OTA的允许量分别不得超过200μg/kg和1000μg/kg。美国也正在制订有关条例。国内GB2761-2011规定谷物、豆类及其制品中OTA的允许量不得超过5μg/kg。目前，检测OTA的经典和权威方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。尽管这些方法灵敏度高、准确性高，但都需要复杂、昂贵的仪器，专业的操作人员，且耗时较长。因此，有必要发展简单、快速、高灵敏、适合现场检测的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种OTA快速检测方法，本方法中的传感器构建过程和检测过程不需要昂贵的仪器和试剂，操作简单，灵敏度很高。本专利技术通过以下的技术方案来实现：本专利技术还提供了一种OTA快速检测方法，包括如下的步骤：(1)在微孔硅纳米材料中负载大量的亚甲基蓝分子；(2)通过核酸适配体将负载了大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料封闭；(3)加入OTA样品和核酸酶的混合溶液；(4)借助丝网印刷电极和便携式电化学检测仪，检测上清液中亚甲基蓝的电信号，间接实现OTA的定量检测；OTA的浓度正比于亚甲基蓝分子的浓度。其中，步骤(3)因OTA与核酸适配体间很强的特异性结合，核酸适配体从微孔硅纳米材料表面脱落，亚甲基蓝分子得以释放。同时加入核酸酶DNaseI，因核酸酶能选择性破坏OTA与适配体间形成的G-四联体结构，OTA又以游离状态回到溶液中，再次重复上述过程。如此往复，可提高检测的灵敏度。同时，本专利技术中所述方法步骤(4)还可以使用血糖仪检测葡萄糖的浓度，来检测OTA的浓度。优选的，一种OTA快速检测方法，具体包括如下的步骤：(1)将10mg微孔硅纳米材料加入2mL含有30mgmL-1亚甲基蓝的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)中，室温过夜轻微振荡，使亚甲基蓝分子充分扩散到微孔硅纳米材料的孔中；(2)将20μL核酸适配体溶液(200μM)加入到步骤(1)所得悬浮液中，4℃轻微搅拌8h后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)离心和洗涤3次以上(以除去微孔硅纳米材料表面物理吸附的亚甲基蓝)，最后将材料分散到2mLTris-HCl缓冲液中；(3)在400μL步骤(2)所制得的悬浮液中，加入400μLOTA样品和核酸酶的混合液(从0到2000nM中选取10个以上的浓度)，室温下轻微振荡孵育2h后，将产物在5000rpm下离心5min；(4)取50μL上清液滴于丝网印刷电极上，用差示脉冲伏安法进行后续的电化学检测，具体参数为：脉冲电压范围为-500—0.0mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度200ms。优选的，步骤(1)和(2)中所述微孔硅纳米材料的质量为10mg；亚甲基蓝和核酸适配体的浓度分别为30mgmL-1和200μM；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)。优选的，步骤(3)中所述核酸酶为DNaseI的浓度为50U。优选的，步骤(4)中所述电化学检测方法为差示脉冲伏安法，具体参数为：脉冲电压范围为-500—0.0mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度200ms；所述用于电化学检测的上清液的体积为50μL。本专利技术旨在通过OTA的核酸适配体封闭负载有大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料，利用OTA与核酸适配体之间的特异性结合，以及核酸酶对两者结合后形成的G-四联体的破坏作用，使大量亚甲基蓝分子得以释放。通过检测加入不同浓度的OTA样品后，体系上清液中亚甲基蓝分子的电信号强度，构建一种基于丝网印刷电极的可以现场、简单、快速、高灵敏检测OTA的新型电化学检测平台，其检测限可低至0.1nM。传感器的整个构建过程无需使用抗体、信号分子标记的适配体等昂贵试剂，成本大大降低；利用微孔硅纳米材料良好的生物相容性、结构可重复性、高负载效率、尺寸可调和易功能化的特点，起到一级信号放大的效果；基于核酸酶的循环信号放大策略，样品被反复使用，亚甲基蓝被不断释放，检测灵敏度得到进一步提高；检测模式中采用基于丝网印刷电极的电化学检测，电极即用即抛、成本低，测试性能很稳定，仪器也易微型化。本专利技术中提供的检测方法具有操作简单、成本低、灵敏度高等特点；同时传感器的构建和使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明，但是本专利技术的范围不受这些实施例的限制。实施例1本实施例提供了一种OTA快速检测方法，包括如下的步骤：(1)将10mg胺基化的微孔硅纳米材料加入2mL含有30mgmL-1亚甲基蓝的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)中，室温过夜轻微振荡，使亚甲基蓝分子充分扩散到微孔硅纳米材料的孔中；(2)将20μL核酸适配体溶液(200μM)加入到步骤(1)所得悬浮液中，4℃轻微搅拌8h后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)离心和洗涤3次以上(以除去微孔硅纳米材料表面物理吸附的亚甲基蓝)，最后将材料分散到2mLTris-HCl缓冲液中；(3)在400μL步骤(2)所制得的悬浮液中，加入400μLOTA样品和核酸酶的混合液(从0到2000nM中选取10个以上的浓度)，室温下轻微振荡孵育2h后，将产物在5000rpm下离心5min；(4)取50μL上清液滴于丝网印刷电极上，用差示脉冲伏安法进行后续的电化学检测，具体参数为：脉冲电压范围为-500—0.0mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度200ms。实施例2本实施例提供了一种OTA快速检测方法，包括如下的步骤：(1)将5mg表面带正电的微孔硅纳米材料加入500mL含有2.0M葡萄糖的Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中，室温过夜轻微振荡，使葡萄糖分子充分扩散到微孔硅纳米材料的孔中；(2)将20μL核酸适配体溶液(200μM)加入到上述悬浮液中，4℃轻轻搅拌8h后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.5)离心和洗涤3次以上(以除去微孔硅纳米材料表面物理吸附的亚甲基蓝)，最后将材料分散到2mLTris-HCl缓冲液中(C[微孔硅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种赭曲霉毒素A快速检测方法，其特征在于，包括以下的步骤：(1)在微孔硅纳米材料中负载大量的亚甲基蓝分子，制得负载大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料；(2)通过核酸适配体将步骤(1)所得负载了大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料封闭；(3)加入赭曲霉毒素A样品和核酸酶的混合溶液；(4)借助丝网印刷电极和便携式电化学检测仪，检测上清液中亚甲基蓝的电信号，间接实现赭曲霉毒素A的定量检测；赭曲霉毒素A的浓度正比于亚甲基蓝分子的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A快速检测方法，其特征在于，包括以下的步骤：(1)在微孔硅纳米材料中负载大量的亚甲基蓝分子，制得负载大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料；(2)通过核酸适配体将步骤(1)所得负载了大量亚甲基蓝分子的微孔硅纳米材料封闭；(3)加入赭曲霉毒素A样品和核酸酶的混合溶液；(4)借助丝网印刷电极和便携式电化学检测仪，检测上清液中亚甲基蓝的电信号，间接实现赭曲霉毒素A的定量检测；赭曲霉毒素A的浓度正比于亚甲基蓝分子的浓度。2.如权利要求1所述的一种赭曲霉毒素A快速检测方法，其特征在于，所述步骤(4)还可以使用血糖仪检测葡萄糖的浓度。3.基于权利要求1的一种赭曲霉毒素A快速检测方法，其特征在于，包括以下的步骤：(1)将10mg微孔硅纳米材料加入2mL含有30mgmL-1亚甲基蓝的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)中，室温过夜轻微振荡，使亚甲基蓝分子充分扩散到微孔硅纳米材料的孔中；(2)将20μL核酸适配体溶液(200μM)加入到步骤(1)所得悬浮液中，4℃轻微搅拌8h后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.0)离心和洗涤3次以上(以除去微孔硅纳米材料表面物理吸附的亚甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王利华，曾令文，王梦，韩艳云，杨保国，吴文辉，胡志娟，
申请(专利权)人：武汉市农业科学技术研究院农业环境安全检测研究所武汉市农业科学技术研究院中心实验室，
类型：发明
国别省市：湖北,42