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一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法技术

技术编号:15434598 阅读:22 留言:0更新日期:2017-05-25 17:51
本发明专利技术提供了一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法,包括如下步骤:步骤1、丝网印刷碳电极SPCE的预处理;步骤2、活化的FB1核酸适配体溶液的制备;步骤3、金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的制备;步骤4、FB1核酸适配体修饰的AuNPs‑SPCE电极的制备;步骤5、电极表面多余活性位点的封闭。本发明专利技术采用金纳米粒子对电极表面进行修饰,一方面,大量的金纳米粒子负载在电极表面为免标记阻抗法检测起到信号放大的作用;另一方面,利用Au‑S键固定更多的巯基化的适配体在电极表面。所提出的FB1的阻抗检测方法具有操作更简便灵活,仪器设备更简单,试剂用量少,检测成本低廉等特点。

A preparation method of electrochemical detection of fumonisin B1 aptamer sensor

The present invention provides a method for preparing an electrochemical detection of fumonisin B1 aptamer sensor, which comprises the following steps: preprocessing step 1, screen printed carbon electrode SPCE; step 2, the activation of FB1 aptamer solution preparation; silk screen printed carbon electrode modified with gold nanoparticles, 3 steps of the system preparation of AuNPs SPCE electrode; step 4, FB1 aptamer modified preparation; step 5, electrode surface excess active site closure. The invention adopts gold nanoparticles modified on the electrode surface, on the one hand, a large number of gold nanoparticles to amplify the signal for label free detection on the surface of the electrode impedance method; on the other hand, the use of Au S key fixed more thiolated aptamer on the electrode surface. The proposed FB1 impedance detection method has the characteristics of simpler and more flexible operation, simpler instrument and equipment, less reagent consumption and low detection cost.

【技术实现步骤摘要】
一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法
本专利技术属于电化学检测领域,特指一种用于玉米中伏马毒素B1灵敏检测的免标记电化学适配体传感器的构建方法。
技术介绍
伏马毒素(FumonisinB,FB)是由串珠镰刀菌产生的一组重要的霉菌毒素,是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。伏马毒素主要存在于谷物中,以玉米及以玉米为主的食品和饲料中居多。由于伏马毒素的毒性具有种属特异性和靶器官特异性,FB的摄入不仅会对人类和动物健康造成潜在的威胁而且会对其大脑,肝脏,肺以及肾脏造成不同程度的损害。现有资料表明,FB可引起马脑质软化症、猪肺水肿和大鼠原发性肝癌,而且对家禽造成免疫抑制作用。此外,研究发现FB可能诱发人类食道癌,肝癌,胃癌等疾病。鉴于以上原因,美国食品和药物管理局公布的指导草案规定玉米产品中伏马毒素(FB1,FB2,FB3)的标准含量应低于2mgkg-1。FB1是污染玉米及玉米制品的主要毒素,已成为继黄曲霉毒素之后的又一个研究热点,国际癌症研究机构将FB1定义为2B类致癌物。FB1具有耐高温性,在多数粮食加工处理过程中均比较稳定,鉴于它的剧毒性和广泛的存在性,建立一种高效快速检测FB1的方法尤为重要。现已有的检测FB1的方法包括薄层色谱法,高效液相色谱法,气相色谱质谱联用法,液相色谱质谱联用法以及免疫测定等研究方法,虽然这些方法能够满足灵敏度与特异性检测的要求,但是在实际应用方面存在一定的局限性。色谱法能够用于定性、定量检测,且检测结果相对准确、可靠,灵敏度高,重现性好,但是所用仪器设备昂贵,操作复杂,需要专业的技术人员,因而不适合大批量样品的处理和分析以及现场的快速检测。酶联免疫检测技术可用于现场快速检测,基于抗原与抗体反应后物理化学性质发生的变化,实现对抗原与抗体形成的免疫复合物进行测定分析。该方法以抗体作为识别元素,但抗体制备需经过动物实验或者细胞实验,繁琐耗时,制备成本高,且所得抗体易受到外界环境干扰,不易存储等,这些不足限制了该方法的推广应用。核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体进化技术筛选出来的一段寡核苷酸序列,它可以折叠成三维结构并通过空间构型互补与靶分子高亲和性、高特异性结合。作为可替代抗体的一种新型识别元件,核酸适配体合成简单,易于储存和运输,化学性质稳定,重现性好,方便再生。除此之外,核酸适配体可被巯基,氨基,荧光团,生物素和酶等功能化,使得传感平台的构建更加灵活。本专利技术以金纳米粒子(AuNPs)修饰的丝网印刷碳电极(SPCE)为载体,以核酸适配体为识别元件用于玉米中FB1的电化学阻抗法检测,构建了一种快速、灵敏检测FB1的电化学适配体传感器,建立了FB1标准品浓度与电化学阻抗值之间的对应关系,实现了简单、灵敏、快速检测FB1的目的。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种免标记、高灵敏度、高选择性、宽测量范围等优点为一体的电化学适配体传感器。该传感器制备工艺简单,成本低,实现了快速定量检测FB1的目的。所采用的方案概括为:以氯金酸为起始原料,以SPCE为载体,利用电化学沉积法实现金纳米粒子在工作电极表面的沉积,创建超灵敏的电化学传感平台。首先,利用电极表面沉积的金纳米粒子优良的导电性能和较大的比表面积等性质,对检测系统起到一个信号放大的作用。然后在金纳米粒子修饰的电极表面偶联巯基修饰的FB1适配体(基于Au-S的共价键合)。当加入目标物FB1标准品,aptamer与FB1特异性结合,对其进行阻抗扫描,建立阻抗值与FB1浓度之间的关系,以达到对含FB1的实际样品进行定量检测的目的。本专利技术是通过如下具体技术方案实现的:一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法,包括如下步骤:步骤1、丝网印刷碳电极SPCE的预处理;步骤2、活化的FB1核酸适配体溶液的制备:用50mMTris-HCl缓冲溶液溶解FB1核酸适配体,使FB1核酸适配体的浓度为100μM,得到溶液A;取20μL溶液A加入到5μL含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的50mMTris-HCl缓冲溶液B中,得到混合液C;然后,将混合液C放置在往复式震荡仪上室温条件下反应1h;最后,离心移去多余的三(2-羧乙基)膦盐酸盐,重新分散在2mL50mMTris-HCl缓冲溶液D中,得到活化的FB1核酸适配体溶液,备用;步骤3、金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的制备:将步骤1中预处理过的SPCE浸入5mL2mMHAuCl4溶液进行金纳米粒子的表面电沉积,得到金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极,记为AuNPs-SPCE,二次蒸馏水淋洗,氮气吹干,备用;步骤4、FB1核酸适配体修饰的AuNPs-SPCE电极的制备:首先取10μL的步骤2中活化的FB1核酸适配体溶液滴涂在步骤1中预处理的工作电极表面,4℃条件下反应6h,得到FB1核酸适配体修饰的AuNPs-SPCE电极,记为aptamer-AuNPs-SPCE,用50mMTris-HCl缓冲溶液淋洗,氮气吹干;步骤5、电极表面多余活性位点的封闭:将步骤4中aptamer-AuNPs-SPCE表面滴涂10μL1mM6-巯基己醇的溶液,室温条件下反应1h,得到6-巯基己醇封闭的电极,之后用50mMTris-HCl缓冲液淋洗,氮气吹干,得到可用于伏马毒素B1检测的免标记电化学适配体传感器,4℃保存备用。步骤1中,SPCE预处理方法为:在5mL含有0.5MH2SO4和0.1MKCl的溶液中对SPCE进行循环伏安扫描,扫描范围设定为-0.2~1.5V,扫描速率为100mVs-1,直到扫描得到重叠的循环伏安曲线,用二次水淋洗,氮气吹干,备用。步骤2中,所使用的Tris-HCl缓冲溶液B中含有的三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为100mM;所使用的Tris-HCl缓冲溶液D中含有0.1MNaCl,0.2MKCl,5.0mMMgCl2和1.0mMEDTA。步骤3中,所述电沉积的电压为0.5V,沉积时间为1200s。步骤2、4、5中,所使用的Tris-HCl缓冲溶液pH均为7.4。所用的FB1核酸适配体序列为:5’-SH-(CH2)6-ATACCAGCTTATTCAATTAATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATTAGATAGTAAGTGCAATCT-3’。所述检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器检测伏马毒素B1的步骤如下:分别取10μL不同浓度的FB1标准溶液滴涂在所述检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的界面上,得到修饰电极;在37℃条件下孵化30min,之后将修饰电极电极用50mMpH=7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗,氮气吹干;将修饰电极置于5mL阻抗液中,扫描电化学阻抗图谱,根据阻抗值与对应的FB1标准样浓度建立标准曲线。所述FB1标准溶液浓度依次是0,0.005,0.01,0.05,0.25,1,2,5,10,50,100ngmL-1;所述阻抗液包括:a.0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH=7.4;b.5mM[Fe(CN)6]3-/4-;c.0.1MKCl。有益效果:本专利技术利用电化学沉积法以及自组装法构建了aptamer-AuNPs-SPCE免标记电化学适配体传感平台,运用核酸适配体对目标物的特异性识本文档来自技高网
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一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法

【技术保护点】
一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1、丝网印刷碳电极SPCE的预处理;步骤2、活化的FB1核酸适配体溶液的制备:用50mM Tris‑HCl缓冲溶液溶解FB1核酸适配体,使FB1核酸适配体的浓度为100μM,得到溶液A;取20μL溶液A加入到5μL含有三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的50mM Tris‑HCl缓冲溶液B中,得到混合液C;然后,将混合液C放置在往复式震荡仪上室温条件下反应1h;最后,离心移去多余的三(2‑羧乙基)膦盐酸盐,重新分散在2mL 50mM Tris‑HCl缓冲溶液D中,得到活化的FB1核酸适配体溶液,备用;步骤3、金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的制备:将步骤1中预处理过的SPCE浸入5mL 2mM的HAuCl

【技术特征摘要】
1.一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1、丝网印刷碳电极SPCE的预处理;步骤2、活化的FB1核酸适配体溶液的制备:用50mMTris-HCl缓冲溶液溶解FB1核酸适配体,使FB1核酸适配体的浓度为100μM,得到溶液A;取20μL溶液A加入到5μL含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的50mMTris-HCl缓冲溶液B中,得到混合液C;然后,将混合液C放置在往复式震荡仪上室温条件下反应1h;最后,离心移去多余的三(2-羧乙基)膦盐酸盐,重新分散在2mL50mMTris-HCl缓冲溶液D中,得到活化的FB1核酸适配体溶液,备用;步骤3、金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的制备:将步骤1中预处理过的SPCE浸入5mL2mM的HAuCl4溶液进行金纳米粒子的表面电沉积,得到金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极,记为AuNPs-SPCE,二次蒸馏水淋洗,氮气吹干,备用;步骤4、FB1核酸适配体修饰的AuNPs-SPCE电极的制备:首先取10μL的步骤2中活化的FB1核酸适配体溶液滴涂在步骤1中预处理的工作电极表面,4℃条件下反应6h,得到FB1核酸适配体修饰的AuNPs-SPCE电极,记为aptamer-AuNPs-SPCE,用50mMTris-HCl缓冲溶液淋洗,氮气吹干;步骤5、电极表面多余活性位点的封闭:将步骤4中aptamer-AuNPs-SPCE表面滴涂10μL1mM6-巯基己醇的溶液,室温条件下反应1h,得到6-巯基己醇封闭的电极,之后用50mMTris-HCl缓冲液淋洗,氮气吹干,得到可用于伏马毒素B1检测的免标记电化学适配体传感器,4℃保存备用。2.根据权利要求1所述的一种检测伏马毒素B1的电化学适配体传感器的制备方法,其特征在于,步骤1中,SPCE预处理方法为:在5mL含有0.5MH2SO4和0.1MKCl的溶液中对SPCE进行循环伏安扫描,扫描范围设定为-0.2~1.5V,扫描速率为100mVs-1,直到扫描得到重叠的循环伏安曲线,用二次水淋洗,氮气吹干,...

【专利技术属性】
技术研发人员:钱静任婵婵王成全徐丽王坤李华明
申请(专利权)人:江苏大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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