一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，所述绿色荧光蛋白突变体以绿色荧光蛋白为母体，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突变为左旋多巴。该方法操作简单，铝离子检测限可达μmol·L

Application of a green fluorescent protein mutant as an aluminum ion detection probe

The invention relates to a green fluorescent protein mutant as the application of aluminum ion detection probe, the green fluorescent protein mutant green fluorescent protein precursor, tyrosine in the amino acid sequence by directed mutation for levodopa. The method is simple and the detection limit of aluminum ion is up to mol L

【技术实现步骤摘要】
一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用
本专利技术涉及铝离子检测领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用。
技术介绍
铝是一种常见的金属，已经被广泛地应用于生活中。但由于食物链堆积、乱用滥用等原因，铝元素极易以铝离子地形式影响生态环境，甚至进入人体内，导致大脑神经退化、记忆力衰退等。因此，对铝离子在不同环境中的浓度检测具有重要的意义。目前，与传统的元素检测法，如原子吸收法、原子发射法和电感耦合等离子体质谱等方法相比，荧光探针检测具有快速、便捷、灵敏度低等优点。但是，目前报导的荧光探针通常都是通过有机全合成的手段获得，制备过程繁琐，而且在合成过程中使用了大量有机试剂、重金属催化剂等。为了检测某种金属离子，却在检测过程中造成了二次污染，有违绿色化学原则。此外，在生物医药分析中，很多检测均在活体中进行，要求荧光探针具有高生物亲和性，无毒无害、易于降解。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一种天然存在在于绿色荧光水母中的蛋白，由238个天然氨基酸构成。经过折叠后，其荧光生色团被很好地包裹在11个β-折叠嵌段之中，形成桶装结构。其荧光发光稳定，效率高，是一种高效的荧光探针。此外，由于蛋白获取过程不涉及任何毒害物质的使用，而且其生物相容性高，被广泛地应用在分子标记、药物筛选、抗体融合、生物传感器等研究领域。Ayyadurai等人(Bioconjugatechemistry,2011,22(4):551-555.)在酪氨酸缺陷型大肠杆菌中培养得到了一种非天然氨基酸嵌入的绿色荧光蛋白(GFPdopa)，蛋白氨基酸序列中的酪氨酸被左旋多巴所替代。该研究对GFPdopa的性质进了研究，但是并未公开将其应用于铝离子的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，该方法操作简单，铝离子检测限可达μmol·L-1级，且选择性高，满足实际样品的检测需要。本专利技术所提供的技术方案为：一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，所述绿色荧光蛋白突变体以绿色荧光蛋白为母体，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突变为左旋多巴。上述技术方案中，由于左旋多巴在水溶液体系中，对铝离子有极高的亲和性。因此当绿色荧光蛋白生色团中的酪氨酸被突变成左旋多巴后，生色团可以与游离的铝离子进行配合，继而产生荧光的变化。所述绿色荧光蛋白母体氨基酸序列已经在Ayyadurai等(Bioconjugatechemistry,2011,22(4):551-555.)发表的文章中公开。所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1。所述绿色荧光蛋白是一种具有荧光生色团的桶状蛋白，可以在正常大肠杆菌中进行表达，其最大荧光发射波长在450～550nm之间，其紫外最大吸收峰在450～550nm之间。所述的绿色荧光蛋白突变体是在酪氨酸缺陷型大肠杆菌中表达；所述绿色荧光蛋白突变体氨基酸总数在为238(不包括Histag标签)，相对分子量在25000～30000道尔顿之间。作为优选，所述绿色荧光蛋白突变体经过透析、冻干后，分散到待测液中进行检测。作为优选，所述检测温度为4～60℃，反应时间在1～60min，待测液pH值为5～9。进一步优选，所述检测温度为15～40℃，反应时间在1～10min，待测液pH值为6～8。作为优选，所述待测液为实际污染液或者模拟缓冲液。作为优选，所述实际污染液为被铝离子污染的土壤浸出液或是被铝离子污染的细胞培养液。作为优选，所述模拟缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)、2-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MES)、3-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)。进一步优选为3-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MOPS)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)。作为优选，所述绿色荧光蛋白突变体在待测液中的添加量为1～10μmol·L-1。同现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：(1)本专利技术提供了一种全新的铝离子检测探针，制备过程绿色无污染，且探针水溶性高，生物相容性好，可以用于生物样品包括细胞内铝离子浓度的检测；(2)本专利技术所提供的探针选择性高，在Na+,K+,Ag+,Ca2+,Mg2+,Ba2+,Zn2+,Cd3+,V3+等不同离子存在下，对铝离子浓度均存在明显响应。具体实施方式以下应用例可以使本专业人员更全面理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。绿色荧光蛋白突变体的表达绿色荧光蛋白突变体采用残基特异性嵌入非天然氨基酸的手段进行定向突变。将含有绿色荧光蛋白质粒DNA的酪氨酸缺陷型大肠杆菌在基本培养基(Minimalmedium)中进行培养，而后在含有左旋多巴的基本培养基中，在IPTG诱导下进行表达。将完全表达后的大肠杆菌裂解，并在用镍柱对裂解上清液进行纯化，其中发出黄绿色荧光的洗脱部分即为目标蛋白。将蛋白溶液透析后再冻干即得到黄绿色固体即为绿色荧光蛋白突变体(GFPdopa)。铝离子浓度的检测是通过将探针与不同待测样品混合后，通过荧光分光光度计计算荧光强度变化得到相应铝离子浓度。应用例11、称取0.14gGFPdopa蛋白固体溶于1LHEPES缓冲溶液(pH＝7.4)中作为检测液(5μmol·L-1)。2、取适量硝酸铝和硝酸钠溶于HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1Na+共存在的模拟污染液。3、将100μL检测液分别与100μLHEPES缓冲液(空白对照)和100μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置5min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al3+浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Na+存在的干扰。应用例21、称取0.28gGFPdopa蛋白固体溶于1LHEPES缓冲溶液(pH＝7.0)中作为检测液(10μmol·L-1)。2、取适量硝酸铝和硝酸钾溶于HEPES缓冲溶液(pH＝7.0)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1K+共存在的模拟污染液。3、将200μL检测液分别与200μLHEPES缓冲液(空白对照)和200μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置1min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al3+浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受K+存在的干扰。应用例31、称取0.14gGFPdopa蛋白固体溶于1LHEPES缓冲溶液(pH＝8.0)中作为检测液(5μmol·L-1)。2、取适量硝酸铝和硝酸银溶于HEPES缓冲溶液(pH＝8.0)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1Ag+共存在的模拟污染液。3、将50μL检测液分别与50μLHEPES缓冲液(空白对照)和50μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置5min，控制检测温度为15℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al3+浓度。结果表明，所述检测探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，其特征在于，所述绿色荧光蛋白突变体以绿色荧光蛋白为母体，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突变为左旋多巴。

【技术特征摘要】
1.一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，其特征在于，所述绿色荧光蛋白突变体以绿色荧光蛋白为母体，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突变为左旋多巴。2.根据权利要求1所述的绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，其特征在于，所述绿色荧光蛋白突变体经过透析、冻干后，分散到待测液中进行检测。3.根据权利要求2所述的绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，其特征在于，所述检测温度为4～60℃，反应时间在1～60min，待测液pH值为5～9。4.根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，其特征在于，所述检测温度为15～40℃，反应时间在1～10min，待测液pH值为6～8。5.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴迪，张丽锋，方文军，郭永胜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33