一种用于蝉花检测的样品制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于蝉花检测的样品制备方法，该方法包括如下步骤：取蝉花待测样品，加水提取，提取液加入甲醇；所述甲醇加入量为至甲醇含量达到20％～50％。本发明专利技术样品制备方法可用于蝉花子实体、孢子粉、菌质或上述物质的提取物或制剂检测中的样品制备，其腺苷提取率高，且稳定性好。

Sample preparation method for cicada flower detection

The invention relates to a method for the detection of cicada sample preparation methods, the method comprises the following steps: Taking the cicada sample to be spent, water extraction, extraction with methanol; the methanol was added to methanol content reached 20% ~ 50%. The invention can be used for sample preparation method, cicada frondosa spore powder, bacteria matter or the substance sample extracts or preparations in the detection of the adenosine preparation, high extraction rate and good stability.

【技术实现步骤摘要】
一种用于蝉花检测的样品制备方法
本专利技术涉及一种用于中药检测的样品制备方法，特别涉及一种用于蝉花检测的样品制备方法。
技术介绍
蝉花(IsariacicadaeMiquel)属于真菌界、子囊菌门、盘菌亚门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草科、棒束孢属(Isaria)。蝉花是我国名贵的中药材，是寄生在蝉(俗称“知了”)上的一种虫草菌。其药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值。主要成分有：腺苷、虫草多糖、虫草酸(甘露醇)、虫草素、尿嘧啶、甾醇、生物碱、维生素、无机盐、矿物质元素等。蝉花具有调节人体免疫的功能，提高食欲，促进睡眠，增强自身抗病的能力。在这些成分当中，虫草多糖具有独特的生物活性，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效，免疫调节作用成为研究开发的热点。腺苷能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用。腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等作用。不仅如此，蝉花中的活性成分ISP-1具有双向免疫调节活性，可以大大的提高器官移植手术的成功率，对患者的康复也有着明显的积极效果。目前，国内已有一些对腺苷含量测定的报道。如《中华人民共和国药典》2010版第一部及《保健食品检验与评价技术规范》中华人民共和国卫生部2003版均有涉及，但本专利专利技术人在进行蝉花样品腺苷测定的验证试验时发现上述方法腺苷的提取及处理方法会导致腺苷的提取率偏低且干扰较多。因此本专利对样品的提取及处理方法等进行了改进。改进后腺苷的提取率提高数倍，不仅方法简单方便干扰较少稳定性好，而且可以适用于蝉花子实体(孢梗束)、蝉花孢子粉、蝉花菌质等蝉花各个部位及其相关制剂，结果令人满意。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于蝉花检测的样品制备方法。本专利技术的目的还在于提供一种蝉花的检测方法。一种用于蝉花检测的样品制备方法，该方法包括如下步骤：A、蝉花待测样品用水提取得提取液；和B、提取液加入甲醇。进一步，所述蝉花待测样品为蝉花子实体、蝉花孢子粉或蝉花菌质中的任意一种，或以任意一种上述物质为原料经提取得到的提取物，或提取物经精制纯化得到的有效部位，或提取物/有效部位按常规制剂工艺制成的临床上可接受制剂。进一步，甲醇加入量为至甲醇含量达到20％～50％(体积百分比)；更进一步，至甲醇含量达到30％～50％；更进一步，至甲醇含量达到40％～50％；更进一步，至甲醇含量达到50％；所述百分比为体积百分比。进一步，所述加水提取方法包括加热提取、回流提取、超声提取等常规提取方法。本专利技术样品制备方法可用于蝉花在常规检测方法中的样品制备，如高效液相色谱法、紫外分光光度法。本专利技术还提供一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，其特征在于该方法中以腺苷为对照品，供试品溶液制备方法包括如下步骤：取蝉花待测样品，加水提取，提取液加入甲醇。进一步，所述蝉花待测样品可以是蝉花的任何部位，具体为蝉花子实体(孢梗束)、蝉花孢子粉或蝉花菌质中的任意一种，或以上述物质为原料经提取得到的提取物，或经进一步精制纯化得到的有效部位，或进一步按常规制剂工艺制成的临床上可接受制剂。进一步，甲醇加入量为至甲醇含量达到20％～50％；更进一步，至甲醇含量达到30％～50％；更进一步，至甲醇含量达到40％～50％；更进一步，至甲醇含量达到50％；所述百分比为体积百分比。进一步，所加述水提取方法包括加热提取、回流提取、超声提取等常规提取方法。进一步，所述方法以乙腈-磷酸二氢盐溶剂系统为流动相，等度洗脱。进一步，所述流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝5-15:85-95；更进一步，流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝5-10:85-90；更进一步，流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝5:95。更进一步，所述磷酸二氢盐溶液浓度为0.02～0.05mol/L；更进一步，为0.04mol/L；更进一步，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。进一步，所述对照品溶液的制备方法为取腺苷对照品，加甲醇水溶液制成对照品溶液；更进一步，所述甲醇水溶液浓度为20％～50％；更进一步，所述甲醇水溶液浓度为50％；更进一步，所述对照品溶液的浓度为20～30μg/mL进一步，所述方法的检测波长为200～300nm；更进一步，检测波长为260nm。本专利技术在水提液中加入一定量的甲醇，意外的发现能够增加样品的稳定性。附图说明图1对照品溶液色谱图图2提取溶剂为20％乙醇的供试品溶液色谱图图3提取溶剂为30％乙醇的供试品溶液色谱图图4提取溶剂为40％乙醇的供试品溶液色谱图图5提取溶剂为50％乙醇的供试品溶液色谱图图6提取溶剂为90％乙醇的供试品溶液色谱图图7提取溶剂为0.5％磷酸水溶液的供试品溶液色谱图图8提取溶剂为25％甲醇水溶液的供试品溶液色谱图(当日测定)图9提取溶剂为25％甲醇水溶液的供试品溶液色谱图(隔夜测定)图10提取溶剂为50％甲醇水溶液的供试品溶液色谱图图11提取溶剂为75％甲醇水溶液的供试品溶液色谱图图12提取溶剂为100％甲醇水溶液的供试品溶液色谱图图13提取溶剂为水的供试品溶液色谱图图14标准曲线图图15实施例8蝉花子实体的色谱图图16实施例8蝉花孢子粉的色谱图图17实施例8蝉花菌质的色谱图图18～26实施例9、13～20的色谱图实验例1提取溶剂的考察1、仪器和材料1.1仪器WatersSymmetryC185μm4.6*250mm；Waters高效液相色谱仪(1525二元高压泵；2998二极管阵列检测器；2707自动进样器；Empower2操作软件)。SB25-12DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；MilliporeSimplicity超纯水仪(美国Millipore公司)；H1650台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；1.2试剂乙腈(HPLC级，4L/瓶，LOT116824，Fisher)；甲醇(HPLC级，4L/瓶，LOT120511，Fisher)；甲醇(AR，500mL/瓶，20120627，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(AR，500mL/瓶，20120111，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(AR，500mL/瓶，T20100416，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(AR，500g/瓶，F20100413，国药集团化学试剂有限公司)；腺苷标准品(20mg/支，110879-200202，中国食品药品检定研究院)；屈臣氏蒸馏水(4.5L/瓶，20111116，上海加州斯帕克林饮用水有限公司)；1.3实验材料蝉花子实体[所述蝉花已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453]。2、方法与结果色谱及检测条件流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5:95)等度洗脱；进样量：10μL；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：260nm。对照品溶液的制备：取腺苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成25μg/mL的溶液，即得。2.1提取溶剂考察：供试品溶液的制备：取蝉花子实体粉末0.2g，精密称定，分别以如下试剂作为提取溶剂：①乙醇水溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蝉花检测的样品制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、蝉花待测样品用水提取得提取液；和B、提取液加入甲醇。

【技术特征摘要】
1.一种用于蝉花检测的样品制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、蝉花待测样品用水提取得提取液；和B、提取液加入甲醇。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蝉花待测样品为蝉花子实体、蝉花孢子粉或蝉花菌质中的任意一种，或以任意一种上述物质为原料经提取得到的提取物，或提取物经精制纯化得到的有效部位，或提取物/有效部位按常规制剂工艺制成的临床上可接受制剂。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇加入量为至甲醇含量达到20％～50％。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲醇加入量为至甲醇含量达到40％～50％。5.一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张忠亮，王玉芹，刘艳菊，尹彬，陈桃宝，胡建峰，施伟勤，顾玲玲，徐煜，孙长胜，
申请(专利权)人：浙江泛亚生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33