一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括27对PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1‑54所示。本发明专利技术基于白内障致病基因高频突变区建立白内障致病基因检测方法，仅通过筛查18个白内障致病基因的26个外显子，就可检测80%的遗传性白内障家系的致病基因。本发明专利技术在不降低检出率的基础上可明显降低白内障致病基因检测的工作量和成本等，具有快速、经济和高效等优势，经本发明专利技术试剂盒的检测，发现了16种不同的白内障基因致病性突变位点，为临床上患者的诊疗和预防干预提供便利。

【技术实现步骤摘要】
一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及基因诊断遗传性疾病领域，具体的说是一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
白内障是由于先天性或后天性因素导致的晶状体混浊，其中先天性白内障在世界范围内的患病率为0.0l％~0.06％，我国约为0.05％。预防先天性白内障引起的视力损害是世界卫生组织（WHO）国际项目“2020年消灭可避免失明”的一个重要组成部分。先天性白内障表现明显的临床异质性，按临床表型可分全白内障、膜性白内障、核性白内障、绕核性白内障、前极白内障、后极白内障、缝状白内障、点状白内障、盘状白内障，珊瑚型等，其发病机制复杂，涉及遗传、代谢性疾病、宫内感染及自发性等因素，其中约有30％-50％与遗传有关，统称为遗传性白内障。遗传性白内障的遗传方式包括常染色体显性、常染色体隐性和性染色体连锁遗传等，其中以常染色体显性遗传为主。据统计我国家族性白内障患者中，常染色体显性遗传的白内障占家族性白内障总数的73%。晶状体的发育是一个非常复杂的过程，涉及许多基因，这些基因任何一个发生突变后都可能导致晶状体混浊，也就是我们所说的白内障。通过研究遗传性白内障去认识在细胞层次发挥不同功能的基因(蛋白质)，是人类认识该类基因乃至其基因家族最为有效的途径。所以从科学理论研究来说，遗传性白内障对于阐明人类基因功能是一个很好的遗传性模式疾病。为了寻找引起白内障的致病基因，常采用的分子遗传学研究方法包括功能克隆(如候选基因筛选和蛋白质分析)、位置克隆、定位候选基因克隆(如基于家系的连锁分析和等位基因共享分析)等。迄今为止，已明确30个基因与单纯遗传性白内障相关，统称为遗传性白内障致病基因，其大致可归为四大类：晶体蛋白基因(CRYAA、CRYAB、CRYBAI/A3、CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGB、CRYGC、CRYGD、CRYGS)、细胞骨架或膜蛋白基因(GJA3、GJA8、MIP、LIM2、BFSP1、BFSP2、EPHA2、TMEM114、CHMP4B、VIM)、转录因子调控基因(HSF4、PITX3)和其他相关基因(GCNT2、FOXE3、WFS1、UNC45B、TDRD7、FYCO1)等。遗传性先天性白内障具有高度的遗传异质性和临床异质性，即不同的基因突变可导致相同表型的白内障，不同表型的白内障可由相同的基因突变造成。由于遗传性白内障致病基因众多，且基因型与表型之间不存在一定的相关性，使其临床基因检测颇具挑战性。随着生物技术的高速发展，特别是外显子组测序及全基因组测序等，为遗传性疾病致病基因突变的筛查和发现提供了快捷的手段，但费用相对昂贵。因此，该类技术常常应用于排除已知致病基因之后，以降低实验的成本风险，否则性价比太高。目标序列捕获测序技术可实现高通量众多已知致病基因突变筛查，具有快捷、高效等优势，但费用较高。从科学严谨性来说，以上新技术筛查到可疑致病基因突变最后仍需金标DNA测序Sanger法进一步验证。因此，在精准医学时代，建立快速、经济又高效的遗传性白内障致病基因检测体系不仅有助于尽快排查白内障家系的已知致病基因，发现新的突变位点，同时又可为发现新的致病基因提供可靠的家系材料及其后继研究方法决策的制定。在临床应用上，可开发成相应的白内障基因诊断试剂盒，为有白内障家族史者提供科学的遗传咨询与产前基因诊断。目前，就我们所知，遗传性白内障致病基因的研究主要限于科研，尚未见临床上有遗传性白内障致病基因检测产品；而检索到与白内障致病基因筛查有关的专利则仅针对单个遗传性白内障致病基因突变检测方法或试剂盒，未见有针对多个遗传性白内障致病基因突变检测试剂盒的专利技术专利申请。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、经济又高效的白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的理论依据是遗传性白内障存在高频致病基因或突变热点区域，具体获得白内障致病基因高频突变谱的操作步骤如下：首先，检索自1997年发现第一个人类遗传性白内障致病基因CRYBB2以来至2014年7月国内外报道与遗传性白内障致病基因及其突变的相关文献211篇，统计299个家系或先证者，涉及30个相关致病基因，分布于16条染色体(chr.1,2,3,4,6,9,10,11,12,13,16,17,19,20,21,22)，鉴定221个单一突变(Uni-mutation)，分布于72个外显子，占基因总外显子数的34.6%(72/205)；随后，分析致病基因的发生频谱，结果显示90.97%的病例数与16个致病基因的突变有关，其发生频谱由高到低依次为GJA8和CRYGD(11.04%)，GJA3和CRYAA(10.03%)，CRYBB2(7.69%)，CRYBA1(6.35%)，MIP(5.02%)，EPHA2,CRYGC,CRYAB和HSF4(4.01%),FYCO1(3.34%),CRYBB1(3.01%),BFSP2(2.68%)，GCNT2和PITX3(2.34%)；其中FYCO1和GCNT2仅涉及常染色体隐性遗传；最后，进一步分析致病基因各外显子发生突变频率，结果显示57.19%的突变位于8个基因的11个外显子上，65.22%的突变位于12个基因的15个外显子上，70.23%的突变位于13个基因的18个外显子上，80.27%的突变位于18个基因的26个外显子上。统计分析结果直观图见附图1，且本专利技术将此18个基因的26个外显子定义为白内障致病基因高频突变外显子。本专利技术提供的白内障致病基因检测试剂盒，该基因检测试剂盒主要检测上述定义的白内障致病基因高频突变外显子的蛋白编码区及其剪切位点连接区，即白内障致病基因高频突变区域，就可以检出80%的遗传性白内障家系的致病基因突变。本专利技术提供的白内障致病基因检测试剂盒，该基因检测试剂盒包括27对PCR引物，是根据上述白内障致病基因高频或热点突变区域的DNA序列，采用Primer和Generunner等生物学软件设计和人工合成；27对PCR引物的具体信息见表1。表1.本专利技术提供的26对引物信息及其PCR条件本专利技术提供的白内障致病基因检测试剂盒组成部件如下表2：表2白内障致病基因检测试剂盒组成本专利技术提供的试剂盒用于白内障致病基因检测方法，该方法主要包括三部分内容：1）应用本专利技术的白内障致病基因检测试剂盒进行PCR扩增目标基因的DNA片段；2）PCR产物的DNA测序分析，发现变异位点；3）鉴定目标基因变异位点是否为致病性突变位点。所述试剂盒的白内障致病基因检测方法，具体操作步骤如下：1）按下表3配制PCR反应液（50μl），混匀置于PCR仪上；表3PCR反应体系（100μl）组成2）按下列条件进行PCR扩增反应：94℃/4min预变性；94℃/30sec,57℃-61℃(退火温度依据不同PCR引物而异，具体参考附表1)/30sec,72℃/1min，30个循环；72℃/4min；4℃保存。3）PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定：取9ulPCR产物，加入1ul的10×上样缓冲液，于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统下检测PCR产物的特异性及其大小是否与预期相符。4）PCR产物的DNA测序分析，发现变异位点：PCR产物经琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白内障致病基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括27对PCR引物，用于PCR扩增白内障致病基因高频突变区，其引物DNA序列分别如SEQ ID NO.1‑54所示。

【技术特征摘要】
1.一种白内障致病基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括27对PCR引物，用于PCR扩增白内障致病基因高频突变区，其引物DNA序列分别如SEQIDNO.1-54所示。2.根据权利要求1所述的一种白内障致病基因检测试剂盒，其特征在于：所述的白内障致病基因高频突变区包括18个白内障致病基因的26个外显子，可检测80%遗传性白内障家系的致病基因。3.根据权利要求1所述的一种白内障致病基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分：5U/ul100uLTaq酶，10×Taq含Mg2+缓冲液2.0mL，2.5mMdNTP混合液1.6mL，权利要求1所述的上、下游引物共27对，每条引物各10pM，10×上样缓冲液1.0mL。4.一种如权利要求1所述的白内障致病基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述方法包括如下：1）应用所述的试剂盒进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：阳菊华，陈晓乐，朱益华，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35