一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法技术

该发明专利技术一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法，涉及细胞生物学与细胞转染领域，通过在细胞膜表面铺展一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，以此来抑制细胞膜表面的流动性，达到大幅提高纳米探针穿透细胞膜的概率的效果。将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面的方法为：步骤1：配制HEPES溶液；步骤2：配制鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的溶液；步骤3：取目标细胞培养溶液，去除细胞培养溶液中的培养液；步骤4：用步骤2获得的混合溶液浸没步骤3获得的目标细胞，静置一段时间；步骤5：去除剩余的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液，获得附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞；步骤6：将步骤5获得的附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞置于培养液中培养至少24个小时。

【技术实现步骤摘要】
一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法
本专利技术涉及细胞生物学与细胞转染领域，通过在细胞膜表面制备一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，专利技术了一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法。
技术介绍
细胞转染方法分为生物转染(慢病毒转染和腺病毒转染)、化学转染(脂质体转染)和物理转染(电穿孔、显微注射和纳米探针技术)，每种方法都有各自的优缺点。目前普遍使用的方法是生物转染和化学转染方法，但是转染后的细胞存在癌变风险，而且细胞毒性增大,转染效率也非常低，转染成功的多能干细胞概率不超过0.1％。物理转染方法安全可靠，这也是近几年大量科学家研究细胞转染的重要方法。在物理转染方法中，电穿孔可以高通量的对细胞进行转染，但是高电压会造成大量的细胞死亡，并且转染过程不可控；显微注射法可以在时间和空间上对细胞进行可控转染，但是很难对贴壁细胞进行直接转染。目前更多的研究者开始关注基于纳米探针技术的细胞转染方法。该方法可以实现直接对贴壁细胞进行单细胞转染，时间和空间可控，可原位观察转染后细胞的生物学特性。但是难点在于商用化的纳米探针对细胞膜的穿透率不高，这会直接影响细胞的转染效率。因此需要增大纳米探针穿透细胞膜的概率。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
的不足专利技术了一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法。本专利技术主要通过在细胞膜表面铺展一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，以此来抑制细胞膜表面的流动性，达到提高纳米探针穿透细胞膜的概率的目的。因而本专利技术的技术方案为一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法，该方法将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面，从而提高纳米探针穿透该细胞细胞膜的概率。进一步的，一种将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面的方法为：步骤1：配制HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液；步骤1.1：将HEPES粉末溶于灭菌的三蒸水中，获得HEPES溶液，每100ml灭菌的三蒸水中溶解1.2gHEPES粉末；步骤1.2：用孔径为0.2uM的过滤器过滤步骤1.1获得的HEPES溶液，将过滤后的溶液密封冷藏放置；步骤2：配制0.2mg/ml鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的溶液；将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液与步骤1获得的HEPES溶液混合，并且使混合溶液中的鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的浓度为0.2mg/ml；步骤3：取目标细胞培养溶液，去除细胞培养溶液中的培养液，获得目标细胞；步骤4：用步骤2获得的混合溶液浸没步骤3获得的目标细胞，静置一段时间，使混合溶液中的鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞表面；步骤5：去除剩余的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液，获得附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞；步骤6：将步骤5获得的附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞置于培养液中培养至少24个小时。本专利技术通过在细胞膜表面铺展一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，以此来抑制细胞膜表面的流动性，达到大幅提高纳米探针穿透细胞膜的概率的效果。附图说明图1为培养皿中的人成纤维细胞和原子力显微镜得到的单个成纤维细胞形貌图；图2为细胞膜表面鼠尾胶原的铺展示意图；图3为探针与细胞相互作用的力曲线图；图4为纳米探针显微图；图5为探针和单细胞作用示意图；图6为针尖穿透细胞膜的力曲线示意图。具体方法步骤1.人成纤维细胞(Fibroblasts简称“FB”)的培养方法成纤维细胞是诱导多能干细胞的主要细胞来源，所以本次实验以人成纤维细胞为例。成纤维细胞培养在35mm直径的培养皿中，培养液为DMEM/HIGHGIUCOSE和10％的胎牛血清(FBS)，细胞培养在37℃,5％CO2的孵箱中，至少培育24小时。2.鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的配制1)、0.05mol/mlHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液的配制①用电子天平称量1.2g的HEPES粉末；②在无菌操作工作台中，将1.2g的HEPES粉末溶于100ml灭菌的三蒸水中；③将上述溶液用一次性0.2uM过滤器过滤掉HEPES粉末，将过滤后的溶液装入培养瓶中，再用封口膜将瓶口封住放置4℃冰箱备用；2)、0.2mg/ml鼠尾胶原Ⅰ型蛋白溶液的配制①在无菌操作工作台中，取1mlHEPES(0.05mol/ml)溶液于1.5ml灭菌的EP管中；②在上述溶液中加入40ul鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液(5mg/ml)，混匀备用。药品来源备注：HEPES粉末：biosharp鼠尾胶原蛋白Ⅰ型：生友生物技术有限公司3.细胞膜表面鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的铺展及验证1)细胞膜表面鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的铺展在细胞膜表面形成鼠尾胶原Ⅰ型蛋白分为以下5个步骤(图2)：1、将成纤维细胞培养在35mm直径的培养皿中，培养液为DMEM/HIGHGIUCOSE(培养基(高糖)含丙酮酸钠)和10％的胎牛血清(FBS)，细胞培养在37℃,5％CO2的孵箱中，至少培育24小时；2、在无菌操作工作台中吸走培养皿中的培养液；3、在无菌操作工作台中向步骤2中的培养皿中加入适量配制好的混合溶液，以浸没细胞为准，然后静置5-10分钟；4、在无菌操作工作台中吸走培养皿中的剩余溶液，这时细胞膜表面会留有一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，图2中为细胞膜表面加粗的曲线；5、再向其中加入培养液(DMEM/HIGHGIUCOSE和10％的胎牛血清(FBS))，培养至少24小时。2)细胞膜表面鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的验证鼠尾胶原Ⅰ型蛋白属于蛋白分子的一种，当细胞膜表面铺展了鼠尾胶原Ⅰ型蛋白后，其表面的蛋白分子相对于没有添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的细胞会增加很多，这时，如果用探针与细胞相互作用，其出现黏着的概率也会相应增加，这可以从探针与细胞相互作用的力曲线反应出来。图3为细胞与原子力显微镜探针相互作用的力曲线，两条曲线分别为进针曲线何回针曲线，当细胞膜表面的蛋白质分子增加后，蛋白质分子的一端就更加容易粘附在探针上，当探针回针时，针会拉裂附着在针尖上的蛋白分子，反映在力曲线上，就是回针时有明显的力的跳变(图3AB段)，这种现象称为黏着现象，对应的跳变力的大小称为黏着力。在实验中，可以对比添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白前后探针出现黏着的概率来证明细胞膜表面是否已经覆盖了鼠尾胶原Ⅰ型蛋白。表1为添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白前后探针出现黏着的概率比较。此时探针的进针速度为2μm/s,力的大小为1nN，对于没有添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的细胞和添加了鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的细胞都各自进行三组独立的实验，每组实验有10个细胞，每个细胞重复5次，最后统计力曲线出现黏着的概率。没有添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白时，回针曲线出现黏着的概率仅为15.2％，添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白以后回针曲线出现黏着的概率的增大60.00％，以此证明细胞膜表面附着了一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白。表1添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白前后探针出现黏着的概率4.基于原子力显微镜的纳米探针穿透细胞膜实验实验分为2组，一组没有添加鼠尾胶原Ⅰ型蛋白，一组添加了鼠尾胶原Ⅰ型蛋白。每组实验独立进行3次，一次实验10个细胞，每个细胞重复5次。实验所用的针尖为商业化金字塔形氮化硅探针，如图4所示，弹性模量0.01N/m～0.3N/m,图5为实验中光学显微镜中探针与单细胞的作用图，针尖对准目标细胞的核区。实验设置的加载条件为1nN，下针速度为2μm/s。图6是探针穿透细胞膜的力曲线，探针穿透细胞膜大致分为三个过程：首先探针逐渐靠近细胞，如图AB段；当探针与细胞接触后探针开始对细胞施加压力，如图BC段；当针尖继续对细胞施加压力，力曲线出现跳变，代表针尖穿透了细胞膜，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法，该方法将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面，从而提高纳米探针穿透该细胞细胞膜的概率。

【技术特征摘要】
1.一种增加纳米探针穿透细胞膜概率的方法，该方法将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面，从而提高纳米探针穿透该细胞细胞膜的概率。2.一种将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞膜表面的方法为：步骤1：配制HEPES溶液；步骤1.1：将HEPES粉末溶于灭菌的三蒸水中，获得HEPES溶液，每100ml灭菌的三蒸水中溶解1.2gHEPES粉末；步骤1.2：用孔径为0.2uM的过滤器过滤步骤1.1获得的HEPES溶液，将过滤后的溶液密封冷藏放置；步骤2：配制0.2mg/ml鼠尾胶原Ⅰ型蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：范娜，彭倍，叶志义，罗德莎，姜文俊，张国成，杨龙祥，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川,51