固体支持物上的样品制备制造技术

本申请涉及固体支持物上的样品制备。提供了用于使用固定的转座酶和转座子末端在表面上产生5'‑加标签的双链靶DNA的固定的文库的方法和组合物。所述方法可用于产生在包括大量平行DNA测序的多种方法中使用的5'‑和3'‑加标签的DNA片段。

【技术实现步骤摘要】
固体支持物上的样品制备本申请是申请号为201480004440.2，申请号为2014年1月8日，专利技术名称为“固体支持物上的样品制备”的申请的分案申请。相关申请本申请要求于2013年1月9日提交的美国临时申请号61/750,682的优先权，其在此通过引用以其整体并入。背景存在很多期望从双链DNA(dsDNA)靶分子产生片段化并加标签的DNA分子文库的方法和应用。通常，目的是从大的dsDNA分子产生较小的DNA分子(例如，DNA片段)，用于用作DNA测序反应中的模板。目前用于双链DNA的片段化和加标签用于在下一代测序中使用的很多方法浪费DNA，需要用于片段化的昂贵的设备，并且片段化、加标签和回收加标签的DNA片段的过程困难、冗长、费力、耗时、低效、昂贵、需要相对大量的样品核酸。另外，这些方法中的很多产生加标签的DNA片段，所述加标签的DNA片段不完全代表包含于加标签的DNA片段从其产生的样品核酸中的序列。因此，本领域需要的是提供当从靶DNA产生加标签的DNA片段文库时快速且方便使用的方法，其能容易地应用到核酸分析方法，诸如下一代测序和扩增方法。概述本文提供了用于固体支持物上的核酸样品制备的方法和组合物。所述方法和组合物特别地涉及用于使用固定至固体支持物的转座子组合物片段化DNA并使DNA加标签的方法和组合物。本文提供的方法和组合物是有用的，例如，用于产生在下一代测序方法等中使用的加标签的DNA片段文库。在一些优选的实施方案中，本专利技术涉及在固体支持物上从来自任何来源的靶DNA制备线性ssDNA片段，用于基因组、亚基因组、转录组、或宏基因组分析，或RNA表达分析，所述靶DNA包括任何感兴趣的dsDNA(包括从RNA制备的双链cDNA)。相应地，本专利技术提供了制备加标签的DNA片段的固定的文库(immobilizedlibraryoftaggedDNA)的方法，所述方法包括：(a)提供具有转座体复合物(transposomecomplex)固定于其上的固体支持物，其中转座体复合物包含结合至第一多核苷酸的转座酶，所述第一多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含转座子末端序列，和(ii)第一标签，所述第一标签包含第一标签域；和(b)在靶DNA藉以被转座体复合物片段化，并且第一多核苷酸的3'转座子末端序列藉以转移至片段的至少一条链的5'末端的条件下，将靶DNA施加于固体支持物；从而产生双链片段的固定的文库，其中至少一条链是用第一标签在5'-加标签的。在一些实施方案中，转座体复合物包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含与所述转座子末端序列互补的区域。所述方法还包括(c)提供溶液中的转座体复合物，并在靶DNA藉以被溶液中的转座体复合物片段化的条件下使转座体复合物与固定的片段接触；从而获得具有一个末端在溶液中的固定的核酸片段。在一些实施方案中，溶液中的转座体复合物可包含第二标签，以使得所述方法产生具有第二标签的固定的核酸片段，所述第二标签在溶液中。第一标签和第二标签可以是不同的或相同的。本文还提供了根据以上方法或其他方法制备的具有加标签的DNA片段的文库固定于其上的固体支持物。例如，本文提供了具有转座体复合物固定于其上的固体支持物，其中转座体复合物包含结合至第一多核苷酸的转座酶，多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含转座子末端序列，和(ii)第一标签，所述第一标签包含第一标签域；本文还提供了产生流通池(flowcell)的方法，包括将多个转座体复合物固定至固体支持物，所述转座体复合物包含结合至第一多核苷酸的转座酶，第一多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含转座子末端序列，和(ii)第一标签，所述第一标签包含第一标签域。所述方法还可包括提供具有多个第一多核苷酸固定于其上的固体支持物，以及使固体支持物与转座酶全酶和第二多核苷酸接触，所述第二多核苷酸包含与转座子末端序列互补的区域。在所述方法的一些实施方案中，所述固定包括(a)提供具有扩增引物偶联至其的固体支持物；(b)使第二多核苷酸与扩增引物之一杂交，所述第二寡核苷酸包含与转座子末端序列互补的区域，以及与第一标签互补的区域；(c)使用聚合酶延伸扩增引物以产生包含与第二多核苷酸杂交的第一多核苷酸的双链体，所述第一多核苷酸直接地固定至固体支持物；以及(d)使固体支持物与转座酶全酶接触，从而在固体支持物上组装转座体复合物。本文还提供了一种微粒群体，所述微粒群体具有固定至其的转座体复合物，所述转座体复合物包含结合至第一多核苷酸的转座酶和第二多核苷酸；其中第一多核苷酸在其5'末端被固定至微粒的表面并且第二多核苷酸与第一多核苷酸的3'末端杂交；并且其中第一多核苷酸包含：(i)3'部分，所述3'部分包含转座子末端序列，和(ii)第一标签，所述第一标签包含第一标签域。本文还提供了产生加标签的DNA片段的固定的文库的方法，所述方法包括使靶DNA与以上微粒群体接触以产生固定的加标签的DNA片段。本文还提供了产生加标签的DNA片段文库的方法，所述加标签的DNA片段文库用于索引定向的组装为较长的序列读段，所述方法包括：提供具有转座体复合物固定至其的微粒群体，所述转座体复合物包含结合至第一多核苷酸的转座酶和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与微粒缔合的索引域；将靶DNA施加于微粒群体，从而产生用索引域加标签的固定的DNA片段。在以上方法的某些实施方案中，第一多核苷酸在其5'末端被固定至微粒的表面并且第二多核苷酸与第一多核苷酸的3'末端杂交；并且其中第一多核苷酸包含：(i)3'部分，所述3'部分包含转座子末端序列，和(ii)索引域；并且其中微粒群体包括至少多个索引域，并且其中单个微粒上的第一多核苷酸共用相同的索引域。本文还提供了用于对多个靶DNA分子测序的方法，所述方法包括：在靶DNA藉以被转座体复合物片段化的条件下，将多个靶DNA施加至具有转座体复合物固定至其上的固体支持物上；从而产生双链片段的固定的文库，其中每个靶DNA的第一部分在所述固体支持物上的第一位置处被附接至所述固体支持物，并且每个靶DNA的第二部分在所述固体支持物上的第二位置处被附接至所述固体支持物；以及绘制所述双链片段的固定的文库的图谱以产生由每个靶DNA连接的位置的组；确定靶DNA的所述第一部分和所述第二部分的序列；以及关联所述位置的组以确定第一部分和第二部分的哪些被所述靶DNA连接，并确定靶DNA分子的序列。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，转座体复合物以至少103、104、105、106个复合物每mm2的密度存在于固体支持物上。在一些实施方案中，转座体复合物包含超活性转座酶，诸如Tn5转座酶。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，标签域可包含例如用于簇扩增的区域。在一些实施方案中，标签域可包含用于引发测序反应的区域。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，固体支持物可包括例如微粒、模式化的表面、孔等。在一些实施方案中，转座体复合物在固体支持物上随机地分布。在一些实施方案中，转座体复合物在模式化的表面上随机地分布。一个或更多个实施方案的细节在附图和以下的说明中被描述。其他的特征、目标、和优势将由说明书和附图，以及由权利要求而明显。本申请提供了以下内容：项目1.一种制备加标签的DNA片段的固定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固体基底结合的转座酶复合物，所述复合物包含：转座酶组分，所述转座酶组分包含至少一个转座酶；寡核苷酸连接物组分，所述寡核苷酸连接物组分包含至少一个寡核苷酸连接物，其中每个连接物包含至少一个双链部分，所述至少一个双链部分包含对于所述复合物的转座酶的识别序列，并且其中每复合物至少一个所述连接物已与特异性结合对的成员结合，接头组分，所述接头组分包含特异性结合对，所述特异性结合对的成员之一与连接物结合，并且所述特异性结合对的另一成员与固体基底结合；和固体基底，其中，当所述复合物包含一个转座酶时，所述转座酶通过一个连接物结合，且当所述复合物包含多于一个转座酶时，至少两个连接物与所述转座酶结合。

【技术特征摘要】
2013.01.09 US 61/750,6821.一种固体基底结合的转座酶复合物，所述复合物包含：转座酶组分，所述转座酶组分包含至少一个转座酶；寡核苷酸连接物组分，所述寡核苷酸连接物组分包含至少一个寡核苷酸连接物，其中每个连接物包含至少一个双链部分，所述至少一个双链部分包含对于所述复合物的转座酶的识别序列，并且其中每复合物至少一个所述连接物已与特异性结合对的成员结合，接头组分，所述接头组分包含特异性结合对，所述特异性结合对的成员之一与连接物结合，并且所述特异性结合对的另一成员与固体基底结合；和固体基底，其中，当所述复合物包含一个转座酶时，所述转座酶通过一个连接物结合，且当所述复合物包含多于一个转座酶时，至少两个连接物与所述转座酶结合。2.如权利要求1所述的复合物，其中，所述复合物包含：转座酶组分，所述转座酶组分包含两个转座酶；寡核苷酸连接物组分，所述寡核苷酸连接物组分包含两个寡核苷酸连接物，其中每个连接物包含至少一个双链部分，所述至少一个双链部分包含对于所述复合物的转座酶的识别序列，其中所述连接物之一已与特异性结合对的成员结合，并且其中一个连接物与一个转座酶结合，且另一个连接物与另一个转座酶结合；接头组分，所述接头组分包含特异性结合对，所述特异性结合对的成员之一与连接物结合，且所述特异性结合对的另一成员与固体基底结合；和固体基底。3.如权利要求1所述的复合物，其中所述转座酶组分包含两个或更多个不同的转座酶。4.一种组合物，所述组合物包含：转座酶复合物，所述转座酶复合物包含：转座酶组分，所述转座酶组分包含至少一个转座酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼尔·安东尼·葛姆雷，杰弗里·保罗·史密斯，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB