骨形态发生蛋白2活性肽及制备方法和应用技术

一种骨形态发生蛋白２活性肽，其特征在于其结构为：Ｓ↑［［Ｐ０４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬＤＤＤ或ＣＣＣＣＤＤＤＳ↑［［Ｐ０４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ。它克服了现有ＢＭＰ－２半衰期短，难以持续的发挥作用以及生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，价格亦非常昂贵，难以大规模生产等不足。具有活性位点能充分暴露、其异位成骨能力较强；较易大规模合成，费用更低，稳定性更好，持续时间长等优点。本发明专利技术还同时公开了这种骨形态发生蛋白２活性肽的制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床医学领域，更具体地说它涉及一种骨形态发生蛋白2活性肽及这种活性肽的制备方法和在医学上促进骨再生、骨缺损修复上的应用。
技术介绍
我国每年因创伤和疾病所致骨缺损患者达数百万，急需大量骨修复材料。近年来，用组织工程学技术，即用人工细胞外基质材料、生长因子与种子细胞复合移植或单独植入修复骨缺损，引起各国高度重视。但目前国内外骨相关研究尚处于起步阶段，有许多问题亟待解决，其中如何研制出具有显著修复骨缺损效果的药物或材料是亟待解决的关键问题之一。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，简称BMPs)是目前唯一能诱导异位成骨的一组细胞因子，迄今已发现了大约15种BMP。目前广泛认为BMP-2是BMP家族中最重要的生长因子，BMP-2诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的能力最强，但其缺点是半衰期短，难以持续的发挥作用。如何大规模的生产BMP-2从而使其在临床上更加广泛地发挥作用一直是骨组织工程研究的一个难点。目前国内外多采用基因工程技术生产BMP-2，但由于其生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，价格亦非常昂贵，难以大规模生产，同时亦存在基因工程产品安全性的问题(Wozney J，Seeherman H.Protein-based tissue engineering in bone andcartilage repair.Curr Opin Biotechnol，2004，15(5)392-398.)。另外，大分子蛋白质吸附在材料表面后会随机折迭，活性位点暴露不充分导致其生物活性不高。另一种方法是运用转基因技术将BMP-2基因转入骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，简称BMSCs)，通过转基因细胞表达BMP-2，然而亦存在转染效率低、表达时间较短及病毒载体的潜在致癌性等缺点(Chadderdon R，Shimer A，Gilbertson L.Advances in gene therapy forintervertebral disc degeneration.Spine J.2004，4(6Suppl)341S-34.)。因此，以BMP-2为基础的基因治疗还远远不能运用于临床。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种骨形态发生蛋白2活性肽。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述骨形态发生蛋白2活性肽的方法。本专利技术的再一个目的是将本专利技术骨形态发生蛋白2活性肽在临床上应用于促进骨再生、骨缺损的修复。本专利技术的目的是通过如下措施来达到一种骨形态发生蛋白2活性肽，其结构为SKIPKASSVPTELSAISTLYLDDD(骨形态发生蛋白2活性肽1)或CCCCDDDSKIPKASSVPTELSAISTLYL(骨形态发生蛋白2活性多肽2)。制备上述骨形态发生蛋白2活性肽的方法为BMP-2氨基酸序列中的BMP-2II型受体具有很多抗原表位，其特征性的“指节抗原表位”(Kirsch T，Sebald W，Dreyer MK.Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.Nat Struct Biol，2000，7(6)492-6.)中具有诱导成骨的核心功能区，其核心功能区中氨基酸序列为(KIPKASSVPTELSAISTLYL)(Saitoa A，Suzuki Y，Ogataa S，et al.Activation ofosteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogeneticprotein-2knuckle epitope.Biochimica et Biophysica Acta，2003，165160-67.)在其一端加上一个磷酸化的丝氨酸，另外一端加上三个天冬氨酸，形成的骨形态发生蛋白2活性肽1(SKIPKASSVPTELSAISTLYLDDD)；或在其一端加上四个半胱氨酸一个磷酸化的丝氨酸，形成的骨形态发生蛋白2活性肽2(CCCCDDDSKIPKASSVPTELSAI STLYL)。两条多肽均通过常规的FMOC/tBu固相多肽合成法(Barany G，Merrifield RB.1979.Solidphase peptide synthesis.InGross E，Meienhofer J.eds.The peptides uol2.New YorkAcademiPc ress.pp 1-284.)采用对碱不稳定的9-芴甲基羰基(Fmoc)保护氨基酸的α-氨基，采用对酸不稳定的叔丁基型或其它保护基团保护氨基酸的侧链官能团，用聚酰胺树脂作为多肽合成的固相载体。所得粗肽经过凝胶层析初步纯化，最后经过高效液相色谱法分析其纯度，冷冻而得。这两条多肽能够极好的模拟天然骨基质的促发及指导生物矿化的功能，在局部形成偏酸的环境，促进局部的钙、磷自组装沉积到体内局部组织中胶原纤维表面，生长成按同一方向排列的、坚硬的羟基磷灰石微型晶体结构，形成与天然骨极为相似的结构，从而发挥与天然BMP-2类似的功能。与常规的骨形态发生蛋白药品相比，该活性多肽具有如下的优点(1)该活性多肽可发挥与其蛋白质类似的作用，同时短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面相应的受体结合，达到其较好生物活性，实验结果表明其异位成骨能力较强(参见说明书中动物体内异位成骨的实验研究)；(2)此活性多肽两端的序列中含有磷酸化的丝氨酸、半胱氨酸(两种氨基酸为极性中性氨基酸)及天冬氨酸(它为酸性氨基酸)，多肽在与相关基质材料结合后，在模拟体液中其两端的这些氨基酸能在材料表面形成磷酸基、羧基等阴离子活性基团。这些阴离子基团是体内促发并指导矿化的重要的功能位点，它们对钙磷离子具有很强的的亲和力，能促进钙磷离子的沉积、晶体的成核生长和自组装矿化，起到调控机体内生物自组装矿化的作用。这几种中性及酸性氨基酸的存在使此活性多肽具有了更好的骨诱导活性，促进了其成骨的效能。我们的研究表明磷酸基等阴离子活性基团能更好的促进基质材料的矿化(参见说明书中材料生物矿化方面的实验研究)；(3)多肽较易大规模合成，费用更低，大大减轻了骨缺损病人的经济负担；(4)多肽在与相关基质材料复合过程中稳定性更好，且复合后随着材料本体的逐渐降解而释放，持续时间更长，达到了缓释的效果，将更好更快的促进骨缺损的修复。附图说明图1为磷酸化丝氨酸的化学结构图。图2为骨形态发生蛋白2活性多肽1在Wistar大鼠体内异位成骨的CT照片图。图3为骨形态发生蛋白2活性多肽2在Wistar大鼠体内异位成骨的CT照片图。图4为光镜下(×10倍)8周时骨形态发生蛋白2活性多肽1异位成骨的HE染色切片图。图5为光镜下(×20倍)8周时骨形态发生蛋白2活性多肽1异位成骨的HE染色切片图。图6为光镜下(×10倍)8周时骨形态发生蛋白2活性多肽2异位成骨的HE染色切片图。图7为光镜下(×10倍)8周时骨形态发生蛋白2活性多肽2异位成骨的HE染色切片图。图8为光镜下(×10倍)8周时置入单纯胶原海绵材料部位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种骨形态发生蛋白２活性肽，其特征在于其结构为：Ｓ↑［［Ｐ０４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬＤＤＤ或ＣＣＣＣＤＤＤＳ↑［［Ｐ０４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓东，郑启新，袁泉，段德宇，刘建湘，段智霞，别婧华，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]