一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用。本发明专利技术提供了一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法包括：以杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6制备A型禽流感病毒单克隆抗体等步骤。其中，细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010。本发明专利技术还提供包括上述A型禽流感病毒单克隆抗体溶液、样品稀释液等的A型禽流感免疫检测试剂盒。本发明专利技术的单克隆抗体效价高、特异性强，用其制备免疫检测试剂盒，可克服交叉反应问题；而且可以分别与禽流感H9亚型、H5亚型产生特异性免疫反应，因此能够扩大了检测效力，同时减少了检测成本。该禽流感ELISA免疫检测试剂盒，灵敏、准确、操作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用。
技术介绍
禽流感(AvianInfluenza，AI)全名是鸟禽类流行性感冒，是由禽流感病毒(AvianInfluenzavirus，AIV)引起的动物传染病。通常只传染鸟类和禽类，但在罕有情况下也会传染猪，甚至传染人。禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽、鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸症状，食量减低，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感也称A型禽流感很严重，发病率、死亡率均很高。不仅在禽类间流行，也会传染给人和畜类。家禽感染高致病性禽流感死亡率几乎是100％；人类感染禽流感死亡率达60％。禽流感的传播途径有三条，一是通过空气传播，二是通过食物经消化道传播，三是通过损伤的皮肤和眼结膜传播。禽流感感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌肉酸痛等，严重者伴有肺炎，心、肾等多器官功能衰竭，导致死亡。禽流感病毒变异较频繁，所以人类至今仍未找到特异的防禽流感的手段。在治疗方面至今未找到特异性杀死禽流感病毒的新药，只是采取一些对症治疗的方法，如用解热药降低体温，用缓解鼻粘膜充血药减轻呼吸困难，用止咳祛痰药舒缓呼吸道等。在预防方面，虽然产生了疫苗，但因禽流感病毒变异很快，往往逃脱了疫苗产生抗体的捕杀。禽流感的诊断试剂有琼脂扩散(AGP)试剂，ELISA免疫检测试剂，PCR基因诊断试剂。琼脂扩散检测试剂灵敏度较低，其检测对象是抗体，不能做早期诊断，因为感染后10天左右才能产生可检测抗体，检测到抗体也不能判定为当次感染所致，因为历次感染产生抗体在体内可存留半年时间。PCR检测试剂灵敏而准确，但需要较昂贵的PCR仪和较专门的技术人才，不便于推广应用。ELISA免疫检测试剂不需要附加设备，可在现场进行检测，免疫反应比较精准，操作简便而不需要专门人才。ELISA免疫检测试剂可分两种，一种是查抗体的，另一种是查抗原的。查抗体最大的缺点是不能做早期诊断，也不能判定为是当次感染所致，所以其检测结果对指导治疗意义不大。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的第一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1)以H9亚型禽流感免疫原，免疫小鼠；2)取免疫小鼠脾脏，制备免疫脾细胞悬液；3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；4)对所述杂交瘤细胞进行筛选阳性克隆细胞；5)对阳性克隆进行克隆化培养，获得A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。优选地，本专利技术所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6；最优选地，所述杂交瘤细胞株为1H7。禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCCNO.8010；分类命名：禽流感病(H9)亚型单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期2013年07月24日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。优选地，本专利技术所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述H9亚型禽流感免疫原为H9亚型禽流感疫苗。优选地，本专利技术所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述小鼠骨髓瘤细胞为Sp20小鼠骨髓瘤细胞株。优选地，本专利技术所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述步骤3)中小鼠免疫脾细胞的浓度为1x108个/ml，所述小鼠骨髓瘤细胞的浓度为2～3x107个/ml。本专利技术的另一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体，其中所述A型禽流感病毒单克隆抗体由禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1H7、1A7或1G6所分泌。本专利技术的再一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7，所述杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCCNO.8010。本专利技术的又一目的在于提供一种A型禽流感免疫检测试剂盒，其中所述免疫试剂盒包括上述A型禽流感病毒单克隆抗体溶液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标抗体液、显色剂及洗涤液。因此，本专利技术提供了A型禽流感病毒单克隆抗体在禽流感临床检测中的应用。我国迄今生产的畜禽病ELISA检测试剂盒，绝大部分都是查抗体的，禽流感ELISA检测试剂盒也不例外。用单克隆抗体建立禽流感ELISA免疫检测试剂盒更是未见报道。令人意外地，本申请的专利技术人成功制备了禽流感单克隆抗体，该抗体能和禽流感H9亚型和H5亚型产生免疫反应，由上以及后续实施例可知，本专利技术的A型禽流感病毒单克隆抗体及其制备方法，至少具有以下优点：1)目前国内已有禽流感免疫检测试剂盒，但却是检测抗体的，不可避免存在以下缺点：a.不能做早期诊断。因为禽流感病毒感染后10天左右才能产生可检测抗体。b.检测阳性结果不能判定为当次感染，因为历次感染抗体可在体内存留半年左右。c.交叉反应不可避免。而本专利技术制备了效价高、特异性强的单克隆抗体，用其制备免疫检测试剂盒，可克服交叉反应问题；因为试剂盒检测对象是抗原，一旦感染即可检出，所以可做早期诊断；因为它检测对象是抗原，所以其阳性检测结果可判定为当次感染，或是带毒。2)本专利技术虽然以H9亚型禽流感病毒抗原为免疫原，但是意想不到地，专利技术人发现本专利技术筛选获得的A型禽流感病毒单克隆抗体可以分别与禽流感H9亚型以及H5亚型产生特异性免疫反应，因此能够扩大了检测效力，能同时检测A型禽流感的几种亚型，减少了检测成本。3)相比于ELISA检测试剂盒，以本专利技术的A型禽流感病毒单克隆抗体建立的禽流感ELISA免疫检测试剂盒，主要特点是灵敏、准确、操作简便，很快可报结果，无需任何附加设备，可做现场检测，采样无需抽血，不给动物造成损害。附图说明图1本专利技术实验例1A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图；图2本专利技术实验例2A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图；图3本专利技术实验例3A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图.具体实施方式以下通过具体实施例进一步对本专利技术的技术方案进行说明，应理解以下仅为本专利技术的示例性说明，并不用于限制本专利技术权利要求的保护范围。实施例1A型禽流感病毒单克隆抗体的制备1、用免疫原来免疫动物选用H9亚型禽流感疫苗(兽药生字(2011)150132066)作免疫原，以Balb/C小鼠作为免疫动物，取雄性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml禽流感疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次。2、免疫脾细胞悬液的制备①免疫第31天取免疫小鼠的脾细胞，放入盛有5ml不完全培养液(不加小牛血清的1640培养液)的平皿中，置200目的不锈钢网上，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃上清。③用不完全培养液30ml倒入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动，使脾细胞重新变成悬液，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清。用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为1x108个/ml。3、Sp20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备选用Sp20小鼠骨髓瘤细胞株，购自第四军医大学细胞工程中心，按照以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以H9亚型禽流感免疫原，免疫小鼠；2)取免疫小鼠脾脏，制备免疫脾细胞悬液；3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；4)对所述杂交瘤细胞进行筛选阳性克隆细胞；5)对阳性克隆进行克隆化培养，获得A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以H9亚型禽流感免疫原，免疫小鼠；2)取免疫小鼠脾脏，制备免疫脾细胞悬液；3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；4)对所述杂交瘤细胞进行筛选阳性克隆细胞；5)对阳性克隆进行克隆化培养，获得A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。2.根据权利要求1所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6。3.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为1H7。4.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述H9亚型禽流感免疫原为H9亚型禽流感疫苗。5.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞为Sp20...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄威权，赵锋，吕葆真，
申请(专利权)人：西安斯凯达生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61