一种梯度组织工程支架制作方法技术

一种梯度组织工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。本发明专利技术可实现梯度复合支架的一次性成形，并显著优化仿生效果，可以很好地进行定量力学强度优化。

Method for manufacturing gradient tissue engineering scaffold

A method for making gradient scaffolds for tissue engineering, including the use of biopolymer materials and hydrogel, using a low temperature deposition 3D printer three grid, forming a hierarchical structure, respectively corresponding to the shallow tangential fiber tangential type grid, corresponding to the middle transition fiber uniform grid and corresponding to the bottom to the normal fiber grid, grid formation support, its pressure resistance increases gradually from shallow to deep in the mechanical strength, shear resistance characteristics from shallow to deep gradually decreased; after the end of the print on the grid for the first time frame freeze drying, after forming the grid pores filled with dECM solution, and second times of freeze drying and removing the solvent component of dECM, is similar to the normal cartilage directional microstructure of composite gradient scaffolds for tissue engineering. The invention can realize the one-time forming of the gradient composite bracket, and can obviously optimize the bionic effect, and can optimize the quantitative mechanical strength well.

【技术实现步骤摘要】
一种梯度组织工程支架制作方法
本专利技术涉及生物组织工程领域，特别是涉及一种梯度组织工程支架制作方法。
技术介绍
组织工程是是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。通过细胞、支架结构与生长因子的混合培养，制造适用于修复人体组织或器官缺损的移植材料，可以实现缺损部位结构的再生和功能的重建。用于人体内的组织工程技术对材料生物特性、物理化学特性等方面提出了较高的要求，其中骨和软骨组织的重建对力学强度的要求最高，也对微观组织形态提出了一定的要求。骨和软骨是人体中较为重要的承力组织，具有力学强度高，结构非均质的特征。复杂的非均质结构，或称为梯度结构，提供了非均匀的力学强度，适于支撑人体的重量和运动导致的应力。软骨组织具有优秀的梯度、非线性、粘弹性的力学性能；骨组织则具备皮质骨-松质骨的二级结构，在减轻重量的基础上具有极高的力学强度。在骨和软骨的组织工程重建中，如修复材料力学强度过弱，则难以承受恢复过程中的体内应力，导致材料变形、修复效果变差；如力学强度过强，也可能出现应力遮挡效应，令修复材料以外的正常组织承担应力减弱，造成骨质疏松等负面影响。因此，仿生的，非线性梯度化的力学强度，对于组织工程支架的设计制造提出了苛刻和重要而要求。此外，微观组织形态的仿生化，对于重建过程中的细胞长入具有积极意义，也具有优化设计的价值。生物3D打印(又称增材制造、快速成形)是一种新兴、灵活的组织工程技术，可以在不产生明显分界面的前提下实现分级/梯度软骨支架的制造。3D打印技术的核心是，依据离散/堆积成形原理的数字化成形——即在计算机的控制管理下，根据零件的CAD模型，通过材料的精确堆积，制造原型或零件，在产品开发与设计、快速工具(RapidTooling)、三维复制和临床医学领域均有应用。定向冷冻是一种控制流体解冻时的温度场实现定向结晶，以令冷冻产物具有定向微观结构的加工方法。与冷冻干燥技术结合，可以获得具有定向微观组织的生物支架。软骨组织具有结构较为简单、组织内无血管等有利条件，在组织工程研究中发展较快，具有较早进入临床应用的前景。然而，常见的软骨支架多为均质或准均质结构，力学强度的仿生性不够。多篇论文及专利CN201410097482中介绍了具有梯度化结构的软骨支架，但其制作方法多为分层粘接、分层浇铸或多材料打印，具有工艺繁琐，粘接/浇铸界面强度较差，难以进行定量力学强度优化等问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于针对现有技术的不足，提供一种梯度组织工程支架制作方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种梯度组织工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。进一步地：所述生物高分子材料为PLGA在1，4-二氧六环溶剂中的分散系，所述水凝胶为天然软骨脱细胞基质dECM在乙酸中的分散系、胶原、壳聚糖或明胶，优选地，PLGA的粘度1.7，浓度0.15g/ml；优选地，打印材料在-20℃下挤出，并进行8h的第一次冷冻干燥。打印时，通过以下任一者或多者来改变网格的压缩和剪切力学强度：(1)提高或降低单层网格的疏密程度；(2)增加或降低单一方向连续打印的网格层数；(3)改变不同方向网格的层数比例。打印使得所述切向型网格的剪切模量略高于真实软骨，法向型网格的压缩模量略高于真实软骨，其余各模量则与真实软骨相当或略低。还包括力学测量确定各层的力学强度，其中针对正面承压的软骨或骨缺损修补的需求，对网格支架各层上下加载压缩或剪切载荷；针对侧面承压的软骨或骨缺损修补的需求，将网格支架绕水平轴旋转90度再进行相应压缩或剪切载荷的加载。三种分层网格在组合时近似于等截面叠加。将三种分层网格相互间进行固接约束，边界和加载条件为周边无约束，上下使用刚体压头的压缩或剪切，调节三种网格在厚度方向的分布比例，通过力学仿真的形变量，反比例换算复合支架力学强度。对于正面承压复合支架，通过下式确定三层的分层比例：对于侧面承压复合支架，通过下式确定三层的分层比例：E＝aE1+bE2+cE3其中E为期望达到的真实软骨力学强度、E1、E2、E3为各分层的力学强度，a+b+c＝1。第二次冷冻时，将灌入dECM的网格支架置放入定向冷冻匣进行定向冷冻，所述定向冷冻匣具有高热导率部分优选紫铜，和低热导率部分优选PLA，在外围具有用PLA隔开的隔热空气层。在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔剂，在加工完毕后，通过溶解除去致孔剂，以获得微观孔径，实现连通度高的分级孔隙结构；优选地，在dECM中加入特定营养物质，如诱导软骨形成的IGF-1蛋白等，以促进软骨组织的形成。本专利技术的有益效果：本专利技术的梯度组织工程支架制作方法，从力学强度和微观组织结构出发进行工艺设计，实现了梯度复合支架的一次性成形，并显著优化了仿生效果，可以很好地进行定量力学强度优化，本专利技术提出的具有梯度结构的组织工程支架制造工艺，能更好地促进组织再生，提供具有非均质梯度特征的组织工程支架，适用于临床应用和研究。本专利技术通过3D打印和定向冷冻技术的结合，实现了一次性成形具有梯度结构的软骨支架，便于进行力学强度的仿生优化，且具有宏观网格和微观组织的二级仿生结构。推广地，这种工艺手段也可以用于制造其他具有力学强度要求的组织工程支架，包括但不限于骨组织和骨-软骨复合组织。附图说明图1为本专利技术实施例软骨打印的三种网格设计思想，提高或降低单层网格的疏密程度(101)；增加或降低单一方向连续打印的网格层数(102)；改变不同方向(通常为横纵两向)网格的层数比例(103)；图2为真实软骨的梯度组织结构示意图；图3为本专利技术实施例三种网格结构示意图，分别为强调切向的切向型网格(301)，均匀网格(302)和强调法向的法向型网格(303)；图4为本专利技术实施例针对正面承压的软骨或骨缺损修补的需求，作为正面承压复合支架(401)，对网格各层上下加载压缩或剪切载荷，以及针对侧面承压的软骨或骨缺损修补的需求，作为侧面承压复合支架(402)，将网格支架绕水平轴旋转90度再进行相应压缩或剪切载荷的加载；图5为本专利技术实施例将灌入dECM的网格置放入定向冷冻匣进行定向冷冻的示意图；图6为本专利技术实施例制作的实际复合支架的切片SEM观察验证图。具体实施方式以下对本专利技术的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本专利技术的范围及其应用。参阅图1至图6，在一种实施例中，一种梯度组织工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。

【技术特征摘要】
1.一种梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。2.如权利要求1所述的梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，所述生物高分子材料为PLGA在1，4-二氧六环溶剂中的分散系，所述水凝胶为天然软骨脱细胞基质dECM在乙酸中的分散系、胶原、壳聚糖或明胶，优选地，PLGA的粘度1.7，浓度0.15g/ml；优选地，打印材料在-20℃下挤出，并进行8h的第一次冷冻干燥。3.如权利要求1所述的梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，打印时，通过以下任一者或多者来改变网格的压缩和剪切力学强度：(1)提高或降低单层网格的疏密程度；(2)增加或降低单一方向连续打印的网格层数；(3)改变不同方向网格的层数比例。4.如权利要求1所述的梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，打印使得所述切向型网格的剪切模量略高于真实软骨，法向型网格的压缩模量略高于真实软骨，其余各模量则与真实软骨相当或略低。5.如权利要求1所述的梯度组织工程支架制作方法，其特征在于，还包括力学测量确定各层的力学强度，其中针对正面承压的软骨或骨缺损修补...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟，弥胜利，郭潇，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东,44