一种基于电化学方法的凝血酶原时间测试卡及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于电化学方法的凝血酶原时间(PT)检测卡及其制备方法。该凝血酶原时间(PT)检测卡由导电基板、化学试剂等部分组成。其中化学试剂具体包括：组织因子、磷脂等主要成分。本发明专利技术制备的凝血酶原时间检测卡能够实现对指尖血或未经凝血处理血样的凝血酶原时间检测，具有准确性高、重复性好等优点，并且制备方法简单、对设备和操作人员技术要求低、可操作性强，在临床检验等领域具有广阔的应用前景。

Prothrombin time test card based on electrochemical method and preparation method thereof

The invention discloses a prothrombin time (PT) detection card based on an electrochemical method and a preparation method thereof. The prothrombin time (PT) detection card consists of a conductive substrate and a chemical agent. Among them, chemical reagents include: tissue factors, phospholipids and other major components. The preparation of prothrombin time test card can be achieved on the fingertip blood or blood coagulation treatment without prothrombin time detection, has the advantages of high accuracy, good repeatability, and simple preparation method, the requirements for equipment and operating personnel is low, strong operability, and has broad application prospect in clinical test field.

【技术实现步骤摘要】
一种基于电化学方法的凝血酶原时间测试卡及其制备方法
本专利技术涉及临床血液诊断领域中的凝血酶原时间(ProthrombinTime，PT)检测，尤其是指一种凝血酶原时间测试卡的制备方法。
技术介绍
凝血功能检测是一项重要的临床检测项目，对于临床各科疾病诊断具有重要意义。通常测定凝血功能的测定包括4项检查内容，即凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。其中，凝血酶原时间(PT)是临床上主要的凝血性能测试指标之一。PT可用于监测口服抗凝剂用量和疗效、相关凝血因子和抑制剂情况、证实相关凝血酶原和纤维蛋白原等的缺陷和抑制物存在情况。PT延长常见于维生素K缺乏、DIC、服用抗凝药物等情况。凝血因子缩短见于血栓性疾病等。另外，由于凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ主要由肝脏合成，因此PT结果也是反应肝功能的一项重要指标。因此，PT检测具有重要的实际意义。PT的测量结果常用凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)等形式表示。体内存在有内源性及外源性两种凝血激活系统。一般认为，无活性的凝血因子Ⅶ与组织因子结合，会很快被活化的因子Ⅹ激活为Ⅶa，从而形成Ⅶa组织因子复合物，进而启动外源性凝血过程。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。PT检测方法就是利用外源性凝血的反应原理，通过向血液样本中加入PT检测试剂，基于一系列酶促反应，测定血浆或全血形成血块所需要的时间，实现对相关疾病或缺陷的诊断。PT试剂通常由自然或重组来源的组织因子、磷脂等物质组成。其中，主要活性成分为组织因子。组织因子也称促凝血酶原激酶、凝血因子Ⅲ等，是由263个氨基酸组成、分子质量为47kDa的跨膜受体蛋白质。组织因子分子中有三个结构域，其中1-219残基组成胞外区，能够与凝血因子Ⅶ高亲和性结合，并作为Ⅶa的辅因子，促进凝血因子Ⅹ转化为因子Ⅹa。磷脂也是试剂的重要组成部分，这是因为充分发挥组织因子的生物学活性，必须在体外与磷脂充分结合。PT检测方法有光化学方法(美国专利US5418141)、电化学方法(美国专利US6060323，中国专利CN201310301617)等，他们都是通过检测血样流动性或血浆浓度改变，完成对凝血酶原时间的测定。美国专利US5314695是制备了一种由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺组成的脂质体，将重组组织因子与制备的磷脂双分子层结合，制备了一种PT检测试剂。但是整个工艺过程十分繁琐，增大了时间成本和生产成本，不利于广泛应用。目前，常规的PT检测也是通过PT试剂完成的，但是这往往需要PT试剂与大型的血凝仪配合使用，这对于设备水平、操作人员的操作技能等都有较高要求。而且，PT测试不仅可以用于检测评估肾脏疾病、凝血缺陷，也常用于华法林抗凝疗法的INR值动态监测，而试剂和血凝仪配套使用，延长了PT测试的周期。不仅如此，市售的凝血试剂往往为干粉状，在使用前还需要预先进行复溶、预热等操作才能进行测试，这就使得实验过程更加繁琐。这都使得PT值的即时检验(point-of-caretesting，POCT)变得几乎不可能。鉴于PT检测在临床上的重要作用，制备一种准确度高、重复性好，并且能够实现PT值即时检测的试剂具有重要现实意义。美国专利US5418141将组织因子、磷脂、盐、Ca2+等在缓冲溶液中充分分散，固定在特殊材质的材料上烘干成膜，制备成一种PT检测卡。所制备检测卡可以通过检测光信号变化，配合小型光电探测器即可完成凝血酶原时间测定，这为实现通过光化学方法测定PT值临床检验提供一种新思路。结合上述经验，目前基于电化学方法，检测PT的文献和专利仍鲜有报道。本专利技术的创新之处在于通过电化学的方法，制备了一种能够实现PT检测的检测卡，所制备的PT检测卡与本司研发的小型设备配套使用，即可完成对PT的临床即时检测。所制备的凝血酶原时间检测卡特征在于，无需与大型设备配套使用，大大降低的测试成本；对操作者的技术水平要求较低，甚至患者自己就能够完成PT检测；所制备的检测卡中的反应试剂以固态形式与血样反应，无需复溶；所制备的检测卡每次使用一条，并且试剂被固定在检测卡上，不存在试剂污染。因此，本专利技术制备的检测卡有望应用于POCT领域，尤其是PT检验的临床实验，具有重要的研究和实践价值。此外，该检测卡制备方法简单、准确度高、易于接受，具有很高的的市场价值。
技术实现思路
根据凝血酶原时间(PT)检测方面的相关研究进展及成果，本专利技术的创新之处在于提供了基于电化学这一方法的凝血酶原时间检测卡，解决在PT检测在POCT领域的技术不足，能够简单快捷的完成对患者PT检测，并且结果具有良好的准确性、重复性。本专利技术制备的凝血酶原时间检测卡，由凝血酶原时间试剂、电化学基板等部分组成。当未经凝血处理的新鲜指尖血或静脉血滴加到附着有凝血酶原时间试剂的导电基板上时，启动外源性凝血过程，相关设备能够采集到电信号的变化，进而测定出PT值。所述凝血酶原时间试剂由组织因子脂化物和缓冲液体系组成。具体步骤包括：(1)将磷脂溶解在含有表面活性剂，pH值为7.0-7.5Tris缓冲溶液(50-200mM)中，搅拌30-60min。其中磷脂含量为0.01％-0.1wt％；(2)将rTF溶解在步骤(1)的溶液中，得到组织因子含量0.005wt％的溶液，超声处理10-30min，工作时间3s，间歇时间2s，使二者充分混合得到组织因子脂化物；(3)将该组织因子酯化物于常温下，在pH7.0-7.5的Tris缓冲溶液(10mM)中，透析6-72h；(4)制备pH7.0-7.5的50mMTris缓冲溶液，并且含有：10-200mM氯化钠、8.2-10.5％wt％海藻酸钠、1.0-4.2wt％甘氨酸、4.5-5.5wt％PEG8000、0.4-1.0wt％硫柳汞、2-4mM氯化钙；(5)采用步骤(4)制备的溶液将步骤(3)制备的溶液稀释1-100倍；(6)将步骤(5)制备的溶液以涂覆或滴加的方式加入在导电基板的特定区域内，在40-80℃下烘干5-30min制备得到凝血酶原时间检测卡。其中，步骤(1)所选择的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺中的至少一种，优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸按照质量比2:1混合。此外，用所选磷脂能够起到相同作用的磷脂也应视为被保护内容。其中，步骤(1)和(4)可选用的缓冲溶液可以为Tris、HEPES、TES、PBS等，浓度范围20-300mM且pH范围为5.0-8.0，但优选为Tris缓冲溶液(pH为7.0-7.5，50mM)。能够在所需pH范围内起到缓冲左右的缓冲体系，也应视为被保护内容。其中，步骤(1)所选择的溶解条件可以为振荡、超声、搅拌等凡能促进和分散作用的手段，均应视为被保护内容，其目的在于使得磷脂充分分散，其中搅拌条件优选为30-60min。其中，步骤(1)所选择的表面活性剂为TritonX-100、Tween-80等中的至少一种，优选为TritonX-100。此外，在体系中能够与所选TritonX-100起到类似同作用的表面活性剂也应视为保护内容。其中，步骤(2)所选择的rTF来源为人、兔、猪等来源中的至少一种，优选为重组人组织因子，且组织因子含量0.001-0.01wt％，优选为0.005wt％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于电化学方法的凝血酶原时间(PT)测试卡及其制备方法，其特征在于：可以基于电化学的方法，实现凝血酶原时间的临床检验。该方法包括：混合一定量的重组组织因子(rTF)和磷脂溶液，制备组织因子脂化物。将组织因子脂化物均匀分散在导电基板上并烘干成膜，从而得到一种基于电化学方法的凝血酶原时间检测卡。

【技术特征摘要】
1.一种基于电化学方法的凝血酶原时间(PT)测试卡及其制备方法，其特征在于：可以基于电化学的方法，实现凝血酶原时间的临床检验。该方法包括：混合一定量的重组组织因子(rTF)和磷脂溶液，制备组织因子脂化物。将组织因子脂化物均匀分散在导电基板上并烘干成膜，从而得到一种基于电化学方法的凝血酶原时间检测卡。2.依照权利要求1所述方法，其特征在于：rTF可以来源于人、兔、猪等，且加入量与所选rTF的活力单位和来源有关，本发明中组织因子脂化物中rTF的活力为10000-40000U/L。3.依照权利要求1所述方法，所述混合方法包括将rTF加入含有磷脂等有效成分的缓冲溶液中，并且充分溶解。4.依照权利要求3所述方法，缓冲溶液pH范围为5.0-8.0，浓度范围为50-400mM，具体选自Tris、HEPES、TES、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等中的至少一种。5.依照权利要求3所述方法，其特征在于，有效成分包括但不限于氯化钠，含量为10-200mM。6.依照权利要求3所述方法，其特征在于，有效成分包括但不限于海藻酸钠，含量为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芳，邱笑违，余占江，
申请(专利权)人：北京乐普医疗科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11