一种评估肿瘤异质性的方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种评估肿瘤异质性的方法及系统。具体而言，本发明专利技术提出了一种分子克隆分析方法，该方法基于高通量测序在循环肿瘤DNA中的多种类型变异检测结果，将所有变异划分为不同的分子克隆，利用分子克隆层级评估肿瘤的异质性。本发明专利技术的方法实现以ctDNA高通量变异检测为基础的肿瘤异质性评估，以有效辅助肿瘤预后和治疗方案制定。

Method and system for evaluating tumor heterogeneity

The invention discloses a method and a system for evaluating tumor heterogeneity. Specifically, the invention provides a molecular cloning analysis method, this method is based on various types of mutation detection results of high-throughput sequencing in circulating tumor DNA, all the variation is divided into different molecular cloning, molecular cloning using heterogeneity level evaluation of tumor. The method of the present invention enables the assessment of tumor heterogeneity based on ctDNA high-throughput variability detection to effectively assist in the prognosis of tumors and the formulation of therapeutic protocols.

【技术实现步骤摘要】
一种评估肿瘤异质性的方法及系统
本专利技术属于生物
，更具体而言本专利技术涉及评估肿瘤异质性的方法和系统。
技术介绍
肿瘤是一种由基因改变引起的疾病。肿瘤往往涉及到多种遗传学变异类型，包括单核苷酸变异(SingleNucleotideVariations，SNV)、短的插入缺失(smallinsertionsanddeletions，indel)、拷贝数变异(CopyNumberVariations，CNV)、结构变异(StructureVariations，SV)等。从肿瘤细胞形成第一个变异开始，便开始了变异积累的过程。随着时间推进和肿瘤的演化，先发生的有害变异为后发生的变异营造有利的维持条件，使肿瘤细胞不断获得或者增强诸如抑制凋亡、无限复制、免疫逃逸等方面的能力，因此肿瘤细胞的变异累积的速度比正常细胞快得多。最终形成的肿瘤其实是具有不同遗传学特性的细胞群体的混合：有些细胞仅携带早期变异，有些则还同时携带后期变异；在这些肿瘤细胞中，变异所涉及的细胞比例也随着其发生时间由早至晚而由大变小；在一个细胞同时发生的变异在肿瘤进化过程中共存亡，涉及的细胞比例相同。肿瘤中的变异的细胞比例分布的复杂性能够反映肿瘤异质性，后者是肿瘤复杂程度的最直接和最重要的体现，其与肿瘤患者预后和生存时间息息相关。目前评估肿瘤异质性多采用同一肿瘤患者的多位点采样和高通量测序的方法，即通过对患者的组织多个位置或多个病灶进行病理取样后，通过高通量测序的方法分析每个取样部位的变异，并对共有变异及变异所对应的细胞比例进行描述和分级统计。该方法有如下缺点：(1)多位点的临床取样存在偏倚性，只能代表所取部位的分子变异特征，不能代表整体肿瘤的复杂度；(2)具有一定的临床风险；(3)部分类型的转移灶难以获取，如胸腹膜转移病灶；(4)不准确性，通过共有变异进行的异质性分析方法，将共有变异辨识为同一层级，并未对共有变异进行具体划分，从而导致部分分析结果不准确(Gerlinger,M.etal.Intratumorheterogeneityandbranchedevolutionrevealedbymultiregionsequencing.TheNewEnglandjournalofmedicine366,883-892,doi:10.1056/NEJMoa1113205(2012)；Hao,J.J.etal.Spatialintratumoralheterogeneityandtemporalclonalevolutioninesophagealsquamouscellcarcinoma.Naturegenetics,doi:10.1038/ng.3683(2016))。此外，也有方法只通过单点采样的拷贝数变异结果对肿瘤异质性进行评估(Oesper,L.,Satas,G.&Raphael,B.J.Quantifyingtumorheterogeneityinwhole-genomeandwhole-exomesequencingdata.Bioinformatics30,3532-3540,doi:10.1093/bioinformatics/btu651(2014))，该方法除了存在取样偏倚性的缺点外，还存在人群覆盖度低的缺点，即只能覆盖部分存在大量拷贝数变异的癌肿或人群。因此，本领域中需要更准确评估肿瘤的异质性的分析方法，以有效地辅助肿瘤预后和治疗方案制定。
技术实现思路
为了更准确评估肿瘤的异质性，本专利技术提出了一种分子克隆(MolecularClone，mClone)分析方法，该方法基于高通量测序在循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)中的多种类型变异检测结果，将所有变异划分为不同的分子克隆，利用分子克隆层级评估肿瘤的异质性。本专利技术的方法实现以ctDNA高通量变异检测为基础的肿瘤异质性评估，以有效辅助肿瘤预后和治疗方案制定。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种评估肿瘤异质性的方法，所述方法包括：1)对患者的游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)进行测序(优选高通量测序)，获得测序信息；2)利用所述测序信息确定ctDNA变异，根据所述测序信息和所述确定的ctDNA变异，计算变异等位频率，确定变异所在区域的实际总拷贝数，计算ctDNA占cfDNA的比例；3)根据所述步骤2)中确定的比例以及ctDNA变异的测序信息和拷贝数信息对所述ctDNA变异进行聚类，聚类得到的每一个簇确定为一个分子克隆，得到聚类的克隆层级；4)根据所述患者的克隆层级对其肿瘤异质性进行评估，所述患者的克隆层级越多，其肿瘤异质性越高。在第二方面，本专利技术提供了一种比较不同患者肿瘤异质性的方法，所述方法包括：利用本专利技术第一方面的方法的步骤1)-3)对所述每个患者计算分子克隆层级，对于不同患者，克隆层级越多，其肿瘤异质性越高。在本专利技术第一或第二方面的一个实施方案中，步骤2)包括：2.1)利用所述测序信息获得变异V(所述变异V选自SNV、indel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的参考等位测序深度(Ri)、变异等位测序深度(Mi)，并计算变异等位频率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，参考等位测序深度(Ri)是测序结果中在相应位点未发生该变异的正常序列的条数；变异等位测序深度(Mi)是测序结果中在相应位点发生该变异的变异序列的条数；2.2)利用变异Vi所在区域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，计算变异Vi所在区域的参考拷贝数(rCNi)和实际总拷贝数(CNi)，如果在步骤1)中使用精确的CNV检测方法(如使用SNP芯片检测)，对于不在男性性染色体上的变异，会得到两条染色体上的等位特异的拷贝数变异(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，从而获取实际的等位特异的拷贝数(CNi,major，CNi,minor)，2.3)ctDNA比例评估：以最大的变异等位频率来评估cfDNA中ctDNA所占比例(CTF)，CTF＝max(VAFi),i＝1,…,n(公式5)在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤3)中，通过预测的变异细胞比例，对变异进行聚类，例如采用PyClone(v0.13，当前最新版本，如非特别注明，以下均指该版本)软件。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤3)中，变异V(SNV/indel/SV)的参考和变异等位深度数据(Ri，Mi)：用于与CTF和CNV一块评估变异肿瘤细胞比例。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤3)中，采用PyClone软件对每个所述变异所在细胞群占所有肿瘤细胞的比例进行预测，软件参数可以设定如下：总体肿瘤细胞比例(CTF)＝变异等位基因频率的最高值；迭代次数＝20000；其他参数为默认。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤3)中，使用PyClone对检出的n个变异V(SNV/indel/SV)进行聚类，除以下几个参数外，均采用默认参数：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，当采用等位特异的CNV数据作为输入时，该参数设置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估肿瘤异质性的方法，所述方法包括：1)对患者的cfDNA进行测序(优选高通量测序)，获得测序信息；2)利用所述测序信息确定ctDNA变异，根据所述测序信息和所述确定的ctDNA变异，计算变异等位频率，确定变异所在区域的实际总拷贝数，计算ctDNA占cfDNA的比例；3)根据所述步骤2)中确定的比例以及ctDNA变异的测序信息和拷贝数信息对所述ctDNA变异进行聚类，聚类得到的每一个簇确定为一个分子克隆，得到聚类的克隆层级；4)根据所述患者的克隆层级对其肿瘤异质性进行评估，所述患者的克隆层级越多，其肿瘤异质性越高。

【技术特征摘要】
1.一种评估肿瘤异质性的方法，所述方法包括：1)对患者的cfDNA进行测序(优选高通量测序)，获得测序信息；2)利用所述测序信息确定ctDNA变异，根据所述测序信息和所述确定的ctDNA变异，计算变异等位频率，确定变异所在区域的实际总拷贝数，计算ctDNA占cfDNA的比例；3)根据所述步骤2)中确定的比例以及ctDNA变异的测序信息和拷贝数信息对所述ctDNA变异进行聚类，聚类得到的每一个簇确定为一个分子克隆，得到聚类的克隆层级；4)根据所述患者的克隆层级对其肿瘤异质性进行评估，所述患者的克隆层级越多，其肿瘤异质性越高。2.一种比较多个患者肿瘤异质性的方法，所述方法包括：1)对所述多个患者样品的cfDNA进行测序(优选高通量测序)，获得测序信息；2)对于每个患者样品，利用所述测序信息确定ctDNA变异，根据所述测序信息和所述确定的ctDNA变异，计算变异等位频率，确定变异所在区域的实际总拷贝数，计算ctDNA占cfDNA的比例；3)根据所述步骤2)中确定的比例以及ctDNA变异的测序信息和拷贝数信息对所述ctDNA变异进行聚类，聚类得到的每一个簇确定为一个分子克隆，得到每个患者样品的聚类的克隆层级；4)根据所述多个患者的克隆层级对其肿瘤异质性进行比较，克隆层级多的患者其肿瘤异质性高。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述步骤2)包括：2.1)利用所述测序信息获得变异Vi,＝1,…,的参考等位测序深度Ri、变异等位测序深度Mi，并计算变异等位频率VAFi，其中，参考等位测序深度Ri是测序结果中在相应位点未发生该变异的正常序列的条数；变异等位测序深度Mi是测序结果中在相应位点发生该变异的变异序列的条数；2.2)利用变异Vi所在区域的CNVi,＝1,…,，计算变异Vi所在区域的参考拷贝数rCNi和实际总拷贝数CNi，如果在步骤1)中使用精确的CNV检测方法(如使用SNP芯片检测)，对于不在男性性染色体上的变异，会得到两条染色体上的等位特异的拷贝数变异(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，从而获取实际的等位特异的拷贝数(CNi,major，CNi,minor)，2.3)ctDNA比例评估：以变异Vi,＝1,…,的最大变异等位频率来评估cfDNA中ctDNA所占比例CTF，CTF＝max(VAFi),＝1,…,。4.根据权利要求1或2所述的方法，所述步骤3)中通过预测的变异细胞比例，对变异进行聚类，例如采用PyClone软件。5.根据权利要求4所述的方法，所述变异Vi,＝1,…,的参考和变异等位深度数据Ri和Mi与CTF和CNV一块评估变异肿瘤细胞比例。6.一种评估肿瘤异质性的系统，所述系统包括：1)用于测序(优选高通量测序)患者的cfDNA的模块；2)用于执行如下步骤的模块：a)接收来自模块1)的测序信息；b)通...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴爱伟，常连鹏，李进，龚玉华，管彦芳，易鑫，杨玲，
申请(专利权)人：北京吉因加科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11