一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法，取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，各种氨基酸和葡萄糖的培养基，在1000转/min的速率下离心3‑5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基5‑6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养；在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至低氧浓度的三气培养箱中继续培养一定时间，将细胞取出，然后用激光器照射细胞一段时间；照射后，吸出多余的培养基，加入100微升10%的CCK‑8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2‑4小时后，用酶标仪检测其吸光度。本发明专利技术不添加外来物质，生物安全性高、毒性小，方法简单，可操作性强。

Method for killing tumor cell by hypoxia assisted thermotherapy

The invention relates to a method for hypoxia adjuvant hyperthermia to kill tumor cells, tumor cell freezing medium number, recovery after adding 1ml, DMEM medium, medium variety of amino acids and glucose, centrifugal at a rate of 1000 /min to 3 after 5 minutes, pour the supernatant, adding fresh 1ml medium. Army uniform after transferred to the new culture dish, continue to add fresh medium 5 6ml, the flask placed in a constant temperature of 37 DEG C culture box; in 24 hours incubation incubator after hatching, the cells attached completely, then put three gas wall cells transferred to hypoxia concentration incubator continue to culture for a certain time, the cell removed, and then use cell laser irradiation for a period of time; after irradiation, the excess medium sucked out, adding 100 edged up 10% CCK 8 reagent, 37 degrees in the incubator and incubated for 2 after 4 hours, The absorbance was detected by enzyme labelling apparatus. The present invention does not add foreign substance, has high biological safety and low toxicity, and has simple method and strong operability.

【技术实现步骤摘要】
一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体地涉及一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法。
技术介绍
活性氧自由基（ROS）是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇。研究发现ROS可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖。其中，浓度的ROS能够影响细胞的一系列信号转导途径。机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，除了引起细胞凋亡、坏死的功能，低浓度的ROS更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进。但是中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。另外，许多的重要细胞活动都与ROS的存在有所关联，其中包括基因表达，转录因子活动，细胞增殖等。但是，过量的产生活性氧自由基会激活导致细胞损伤或死亡的细胞活动。此外，也曾有报道显示，细胞缺氧处理往往伴随着活性氧自由基的产生。特别是，肿瘤细胞内的环境是有超过一般细胞的ROS含量。但是这种ROS含量不足以杀死肿瘤细胞，甚至对肿瘤细胞有增值的作用。更为重要的是，肿瘤的低氧环境对放化疗有免疫作用，降低了放化疗的效果。因此，开发针对低氧环境的治疗手段具有重要的研究价值。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术提供一种低氧环境杀灭肿瘤细胞的方法，该方法将肿瘤细胞在低氧环境中培养一定时间后，通过激光照射加热细胞，从而杀灭肿瘤细胞。该方法操作简单，适合大规模推广。为了实现这样的目的，在本专利技术的技术方案中，首先将肿瘤细胞在低氧环境中培养，然后通过激光器照射肿瘤细胞，通过酶标仪检测细胞的生存状态。本专利技术的方法包括如下步骤：一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，各种氨基酸和葡萄糖的培养基，在1000转/min的速率下离心3-5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基5-6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养；（2）在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至低氧浓度的三气培养箱中继续培养一定时间，将细胞取出，然后用激光器照射细胞一段时间；（3）照射后，吸出多余的培养基，加入100微升10%的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（CCK-8）试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度。所述的步骤（2）中，低氧浓度为0.5%-20%。所述的步骤（2）中，培养时间为4-48小时。所述的步骤2中，激光器波长为780-980nm。所述的步骤（2）中，辐照时间为5-15分钟。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术的优点在于：本专利技术的优点在于：（1）肿瘤本身就处于低氧环境，再进行低氧处理能有效降低肿瘤细胞的生存能力，使其达到凋亡或者死亡的临界。（2）低氧处理后的肿瘤细胞再热疗时，能降低热疗的时间，达到快速杀灭的效果，降低了正常细胞的损伤几率。本专利技术不添加外来物质，生物安全性高、毒性小，方法简单，可操作性强。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例11.取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，在1000转/min的速率下离心3分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基5ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养。2.在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至1%浓度的三气培养箱中继续培养4小时。将细胞取出，然后用980nm激光器照射细胞5分钟。3.照射后，吸出多余的培养基，加入100μ10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度。检测结果：OD值=0.65。实施例21.取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，在1000转/min的速率下离心3分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养。2.在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至1%浓度的三气培养箱中继续培养48小时。将细胞取出，然后用980nm激光器照射细胞10分钟。3.照射后，吸出多余的培养基，加入100μ10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度。检测结果：OD值=0.32。实施例31.取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，在1000转/min的速率下离心5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养。2.在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至5%浓度的三气培养箱中继续培养24小时。将细胞取出，然后用780nm激光器照射细胞10分钟。3.照射后，吸出多余的培养基，加入100μ10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度。检测结果：OD值=0.26。实施例41.取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，在1000转/min的速率下离心5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养。2.在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至15%浓度的三气培养箱中继续培养48小时。将细胞取出，然后用780nm激光器照射细胞10分钟。3.照射后，吸出多余的培养基，加入100μ10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度。检测结果：OD值=0.57。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，各种氨基酸和葡萄糖的培养基，在1000转/min的速率下离心3‑5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基5‑6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养；（2）在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至低氧浓度的三气培养箱中继续培养一定时间，将细胞取出，然后用激光器照射细胞一段时间；（3）照射后，吸出多余的培养基，加入100微升10%的2‑(2‑甲氧基‑4‑硝基苯基)‑3‑(4‑硝基苯基)‑5‑(2,4‑二磺酸苯)‑2H‑四唑单钠盐（CCK‑8）试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2‑4小时后，用酶标仪检测其吸光度。

【技术特征摘要】
1.一种低氧辅助热疗杀灭肿瘤细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）取肿瘤细胞冻存液若干，复苏后加入1ml，DMEM培养基，各种氨基酸和葡萄糖的培养基，在1000转/min的速率下离心3-5分钟后，倒掉上清液，再加入1ml新鲜培养基，吹打均匀后转移至新的培养皿中，继续加入新鲜培养基5-6ml，将培养瓶放置于37℃恒温培养箱中培养；（2）在培养箱孵育24小时后，待细胞完全贴壁后，再将贴壁细胞转移至低氧浓度的三气培养箱中继续培养一定时间，将细胞取出，然后用激光器照射细胞一段时间；（3）照射后，吸出多余的培养基，加入100微升10%的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基...

【专利技术属性】
技术研发人员：何丹农，朱君，王杰，乔宇，易帆，金彩虹，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31