The present invention discloses a method for preparing Human Prothrombin Complex from plasma. The invention adopts DEAE A 50 gel from plasma direct adsorption of Human Prothrombin Complex, will the adsorption of A 50 gel loading in a fixed bed column, loaded column chromatography using peristaltic pump into the eluent online washing and elution, elution was inactivated by S/D, the fixed bed column two chromatography and purified by Human Prothrombin Complex products. The method of the invention by gel column elution elution online to realize accurate control of flow and speed, reduce the open operation caused by pollution, contamination, leakage and other problems of gel, the product purity is high, more than IX factor titer was 27IU/ml, IX factor of 0.8IU/mg protein than activity. At the same time using a differential pressure controller and solid automatic stripping system self flushing type filter, the filtering process pressure is stable and controllable, the protective effect on the gel particles, the filtering process into the plasma can significantly reduce the gel broken particles, the production process of the loss can be reduced by more than 20%.
【技术实现步骤摘要】
一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法
本专利技术属于生物制药和血液制品
,具体涉及血液制品制备中一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法。
技术介绍
人凝血酶原复合物(Prothrombincomplexconcentrate,PCC)来自健康人血浆,是一种传统的血浆蛋白制品,除用于治疗乙型血友病外,还可用于治疗因维生素K缺乏或肝病而引起的出血症等,随着临床医生的逐步认可,PCC使用量也在逐年增加。目前,我国生产PCC的厂家不多,加之原料血浆紧张,PCC出现严重短缺,因此,其生产制备引起了各方面的关注。目前制备人凝血酶原复合物的经典工艺为荷兰红十字血液中心提出的批式吸附工艺:用弱阴离子交换剂如sephadexDEAEA-50从原料血浆中吸附II,VII,IX,X四种凝血因子,将吸附后的A-50凝胶利用滤网分批捞出,用低离子强度的缓冲液洗涤去除吸附力弱的杂蛋白和黏附的其他成分,然后增加缓冲液的离子强度洗脱所要的蛋白,再作后续加工处理。批式吸附工艺为开放式操作,操作繁琐,且容易引起污染,交叉污染,凝胶泄漏等问题。国内人凝血酶原复合物也有以cohn法的组分Ⅲ为起始原料进行制备的报道,但此方法容易出现凝血酶原激活现象,引起用药者凝血反应,存在较大的安全隐患。
技术实现思路
本专利技术提供了一种采用DEAEA-50凝胶从血浆中直接吸附出人凝血酶原复合物,将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗涤和洗脱,洗脱液经S/D灭活,灭活液不经透析浓缩直接稀释至电导值<1000us,然后使用固定床层析柱二次层析纯化得到高纯 ...
【技术保护点】
一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)血浆冷沉淀的去除:以新鲜冷冻人血浆为原料,经融浆,混浆,连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀,得到无冷沉淀的血浆离心上清液;(2)凝胶批吸附:血浆温度控制在10‑15℃,按照1.0‑1.5g干凝胶/L血浆,向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE‑sephadex A‑50凝胶,搅拌吸附45min后关闭搅拌,静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用带有压差控制器和固形物自动剥离系统的自冲洗型连续过滤器进行过滤,收集吸附后的A‑50凝胶,血浆滤过液并入血浆罐;(3)装柱洗脱:将吸附后的A‑50凝胶装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗,洗涤液流速为30‑40cm/h,冲洗时间约60‑90min。洗涤后的A‑50凝胶使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗脱,洗脱液流速为30‑40cm/h,待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱,收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤;(4)S/D灭活并稀释:温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中,添加完毕后搅拌30min。调整液温为24‑2 ...
【技术特征摘要】
1.一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)血浆冷沉淀的去除:以新鲜冷冻人血浆为原料,经融浆,混浆,连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀,得到无冷沉淀的血浆离心上清液;(2)凝胶批吸附:血浆温度控制在10-15℃,按照1.0-1.5g干凝胶/L血浆,向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE-sephadexA-50凝胶,搅拌吸附45min后关闭搅拌,静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用带有压差控制器和固形物自动剥离系统的自冲洗型连续过滤器进行过滤,收集吸附后的A-50凝胶,血浆滤过液并入血浆罐;(3)装柱洗脱:将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗,洗涤液流速为30-40cm/h,冲洗时间约60-90min。洗涤后的A-50凝胶使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗脱,洗脱液流速为30-40cm/h,待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱,收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤;(4)S/D灭活并稀释:温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中,添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃,灭活6h。灭活后采取添加稀释液稀释的方法将电导值降至800-1000us;(5)固定床柱层析:将captoDEAE阴离子交换凝胶装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液平衡2-5个柱体积,S/D灭活后的稀释液使用蠕动泵层析柱,上样流速为30-40cm/h。上样完成后使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗,洗涤液流速为30-40cm/h,冲洗时间约60-90min。洗涤...
【专利技术属性】
技术研发人员:蒋桂香,朱光祖,胡川,骆燕容,罗观文,洪好武,梁栋立,
申请(专利权)人:广东双林生物制药有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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