一种抗菌肽制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种新型抗菌肽，其氨基酸序列：KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF。药效学试验表明，本发明专利技术所述的抗菌肽对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等具有抑制作用，并且不引起红细胞溶血，可用于制备抗菌药物。

An antibacterial peptide

The invention relates to the field of biological medicine, in particular to a novel antibacterial peptide, wherein the amino acid sequence is KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF. The pharmacodynamics test shows that the antibacterial peptide of the invention can inhibit Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis and does not cause hemolysis of red blood cells, and can be used for preparing antibacterial drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽
本专利技术涉及一种抗菌肽，该肽为人工设计合成的含30个氨基酸残基的直链肽。
技术介绍
抗菌肽是一类有生物学活性的小分子多肽，通常是由12～60个氨基酸组成。富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，并且通常含有高于30％的疏水性氨基酸。抗菌肽大多为两亲性且带有一定量的正电荷，为阳离子多肽。自1928年Fleming发现青霉素以来，人们逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而大量广谱抗生素的使用加速了致病菌的进化，使得近些年大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。但是抗菌肽也存在一些缺点，主要是有些抗菌肽的溶血活性太高。还有些临床应用问题，如抗菌肽的成本高、体内有限稳定性、微生物耐受性(膜变异)、异质性、未知毒理和药代动力学等。
技术实现思路
本专利技术设计了一种新型的抗菌肽，它的溶血活性小，不易引起副作用。本专利技术的抗菌肽序列为：KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF本专利技术所涉及的多肽用固相合成法制备，技术成熟，产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。药效学试验证明本专利技术的多肽能抑制或杀灭。毒副作用试验表明本专利技术的多肽对绵羊红细胞未观测到溶血活性，说明其溶血活性低，副作用小。本专利技术的多肽也可以和药学上可接受的盐结合，同样具有其药效。这些盐包括(但不局限于)与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。其他盐包括与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。药学上可接受的盐优选钠盐。本专利技术公开了一种抗菌肽制成的制剂，其中含有该多肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。上述多肽可以制成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。上述各种剂型均可以根据药学领域的常规方法制备。可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。一般地，本专利技术的使用剂量在0.001～10克/天，也可以根据疾病的情况偏离这个剂量范围。下面是本专利技术的多肽的部分药效学试验及结果，所用多肽是根据以下序列，委托上海昕浩生物有限公司合成，采用标准的Fmoc固相化学合成方法，即由去保护和激活交联两个反应反复循环而最终将制备肽合成。使用C18制备柱，采用高效液相色谱(HPLC)法纯化多肽，纯度达到95％以上，并通过质谱(MS)进行多肽鉴定。Peptide1序列为(本专利保护序列)：KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLFPeptide2序列为KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLFWATGGNAGWNKPeptide3序列为KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF-NH2一、微量肉汤法测定MIC：1.挑选单个菌落到10ml液体培养液试管中，置37℃，200转，摇床培养，让菌液生长到对数生长期(OD600值约为0.5)。培养时间为：金黄色葡萄球菌(5-6小时)、枯草芽孢杆菌(10-12小时)、单核增生李斯特氏菌(10-12小时)。2.将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌的种子液用培养基分别稀释到OD600值为0.08-0.1之间的菌悬液。3.在96孔板的第一个孔加入180μl稀释的菌悬液，2-11个孔加入100μl稀释的菌液，12孔加入无菌LB培养基或PYG培养基作为对照。4.在第一个孔加入20μl药物母液，混匀，取100μl至第二个孔，依次稀释，使多肽母液一次倍比稀释为256、128、64、32、16、8、4μg/ml。每株菌做3行平行。用头孢呋辛代替多肽母液，作为阳性对照；用培养基代替多肽母液，作为阴性对照。5.置于37℃培养4小时后，用酶标仪测定OD595值，观察菌体生长情况。6.以不生长细菌的最小药物浓度作为MIC值。抑菌试验结果如表1～表3所示，+号表示孔内有菌生长，一号表示孔内没有菌生长。从试验结果可以看出Peptide1对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特氏菌都有一定的抑菌效果，MIC在32～64μg/ml；Peptide2对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有弱的抑制效果，MIC在64～256μg/ml，但对李斯特氏菌没有抑制效果；Peptide3对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特氏菌的抑菌效果相对较高，MIC在16μg/ml；表1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果表2对枯草芽孢杆菌的抑菌效果表3对李斯特氏菌的抑菌效果二、溶血毒性试验1、红细胞悬液的制备：取脱纤维的绵羊血红细胞10ml，加入离心管中，加入10ml生理盐水洗涤后离心，离心力设定为3000g，离心3min，取出后弃上清，留底部细胞，反复洗涤直到上清液不显红色之后弃去上清液，吸取2ml下层沉淀物，加入生理盐水稀释至100ml，配成2％的红细胞悬浮。2、药液准备：称样配置浓度为2560μg/ml的多肽母液500ml，依次稀释，最后获得浓度分别为256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml的多肽溶液。另准备3个EP管，一个加600μl生理盐水作底色管，一个加300μl蒸馏水做阳性对照管，另一个加300μl生理盐水作阴性对照管。3、将各EP管放到37℃恒温锅中孵育30min后，取不同浓度的多肽药液300μl分别和300μl红细胞悬液混匀，阳性对照管和阴性对照管也分别加入300μl红细胞悬液混匀。放到37℃恒温锅中孵育1小时。4、取出EP管，用6000rpm转速离心5min，离心完成后肉眼观察上清，取上清液100μl加入96孔板中，至酶标仪570nm测OD值。独立三次重复实验。5、计算溶血度。溶血度计算公式：样品吸光度＝式样管吸光度-底色管吸光度；溶血度＝(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％6、溶血度大于5％的浓度标注为溶血溶血毒性试验结果如表4所示，一号表示未观测到溶血，+表示观测到溶血。Peptide1在测定的浓度范围内不会引起绵羊红细胞溶血，Peptide2在128μg/ml浓度下会引起溶血，溶血度为7.86％，Peptide3在32μg/ml浓度下有毒性，溶血度为23.82％；表4多肽对绵羊血的溶血毒性结果上述试验结构表明，虽然Peptide3抑菌活性较高，但是它的毒副作用较大，在32μg/ml浓度下有就能引起绵羊红细胞溶血，不能作为抑菌药物口服或注射。而Peptide1不会引起红细胞溶血，对金黄色葡萄球菌等又有较好的抑菌效果，作为本专利保护的多肽。具体实施方式实施例1含抗菌肽抑菌溶液的制备根据Peptide1所示序列，委托上海昕浩生物有限公司合成多肽，称取64mg多肽，溶于500ml去离子水中，加入100ml甘油，20ml无水乙醇，搅拌均匀后，补充去离子水到1000ml。该抑菌溶液可以用于手部、面部的清洁，加入的甘油还可以起到保湿防冻的作用。实施例2含抗菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽含以下氨基酸序列的肽或其药学上可接受的盐：KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽含以下氨基酸序列的肽或其药学上可接受的盐：KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF。2.一种抗菌药物，其中含有权利要求1的肽或其药学上可接受...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑珩，余永柱，张彦，鲍劲霄，孙影，
申请(专利权)人：南京广方生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32