一种脐血造血干细胞冻存管制造技术

本发明专利技术公开了一种脐血造血干细胞冻存管，包括冻存管主体，该冻存管主体的内壁设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。本发明专利技术提供的冻存管内壁含有γ聚谷氨酸包被层，使用本发明专利技术冻存管冻存脐血造血干细胞时，‑80℃冻存6个月细胞数量和活性无明显下降，显著优于现有技术。因此，脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明专利技术提供的冻存管在‑80℃冻存；超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。

Umbilical cord blood stem cell freeze tube

The invention discloses a cord blood hemopoietic stem cell freeze tube, which comprises a frozen storage tube body, wherein the inner wall of the main body of the freezing storage tube is provided with a coating layer and the coating layer is made of gamma glutamic acid material. The invention provides a freezing tube wall containing gamma polyglutamic acid coated layer, using the frozen vials of umbilical cord blood hematopoietic stem cells, 80 C frozen for 6 months the number and activity of cells decreased significantly, significantly better than the existing technology. Therefore, umbilical cord blood hematopoietic stem cells within 6 months of short-term preservation can be freezing tube in 80 DEG C freezing provided by the invention; more than 6 months of long-term cryopreservation suggest the use of liquid nitrogen preservation.

【技术实现步骤摘要】
一种脐血造血干细胞冻存管
本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种脐血造血干细胞冻存管。
技术介绍
脐血干细胞是脐血中的一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。脐血造血干/祖细胞具有高度的自我更新能力或复制能力，能保持干细胞数量恒定，并能进一步分化为各系祖细胞及成熟细胞。CD34抗原是分离纯化造血干/祖细胞的主要标志，脐血中的CD34+细胞群在数量、质量和增殖能力方面高于外周血，脐血中的造血干/祖细胞具有更原始、更强的增殖分化能力。近年来，脐血造血干细胞移植已发展为一种高科技生物治疗手段，广泛应用于许多疾病的治疗，包括恶性血液病、自身免疫性疾病、严重免疫缺陷症等，临床证明具有一定的疗效。冷冻保存是脐血保存和造血干细胞移植的关键。已知，脐血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后的数量和活性无明显变化，冻存效果较好，因而建议脐血干细胞长期保存应置于液氮中。鉴于-80℃冻存的方法方便、成本较低、应用广泛，6个月以内的冻存采用-80℃冻存更为方便。徐长根等研究(-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响，临床输血与检验2010年4月第12卷第2期)发现，脐血细胞在-80℃下保存1、2、3、4、8周后，各组的有核细胞数和CD34+数的差异无统计学意义，而在冻存16、32周后较1周的差异有统计学意义(P<0.05)。台盼蓝拒染率在8、16、32周较1周的差异均有统计学意义(P<0.05)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脐血造血干细胞冻存管，用于脐血造血干细胞在-80℃条件下6个月以内的有效冻存。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种脐血造血干细胞冻存管，包括冻存管主体，该冻存管主体的内壁设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。优选地，所述γ聚谷氨酸的分子量为70万克/摩尔。优选地，γ聚谷氨酸包被层的厚度为0.2-0.4mm。一种制备上述脐血造血干细胞冻存管的方法，包括如下步骤：步骤S1，将无菌γ聚谷氨酸溶于无菌水中，制成浓度为0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售冻存管中，置于35-45℃无菌条件静置2-4小时；步骤S3，倾倒冻存管中剩余溶液，用无菌水清洗2-3次，置于无菌条件备用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的冻存管内壁含有γ聚谷氨酸包被层，使用本专利技术冻存管冻存脐血造血干细胞时，-80℃冻存6个月细胞数量和活性无明显下降，显著优于现有技术。因此，脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本专利技术提供的冻存管在-80℃冻存；超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。附图说明图1为本专利技术冻存管结构示意图，图中1为γ聚谷氨酸包被层；图2为包被冻存组和常规冻存组6个月冻存期内台盼蓝拒染率变化。具体实施方式下面结合具体实施例和附图详细介绍本专利技术的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。实施例1本专利技术冻存管的制备取市售2mL康宁冻存管自制本专利技术提供的冻存管，具体步骤如下：步骤S1，将无菌γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌，分子量70万克/摩尔)溶于无菌水中，制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取2mLγ聚谷氨酸溶液加入2mL康宁冻存管中，于40℃无菌条件静置3小时；步骤S3，倾倒冻存管中剩余溶液，用无菌水清洗3次，置于无菌条件备用。显微镜观察显示，冻存管内壁形成均匀的γ聚谷氨酸包被层，包被层厚度0.3mm。γ聚谷氨酸溶液的浓度可以在0.1-0.2mg/mL之间调整，静置温度在35-45℃之间调整，静置时间4-5小时，最终获得的包被冻存管内壁的γ聚谷氨酸包被层厚度在0.2-0.4mm之间。其他规格的冻存管制备方法类似。当然，为了提高科研人员的工作效率，可以制备成预包被冻存管成品销售给科研人员。实施例2冻存管内壁包被对冻存效果的影响一、实验方法1、脐血造血干细胞分离肝素抗凝的脐血用Ficoll作密度梯度离心获得脐血单个核细胞，洗涤后用RPMI1640培养液制成细胞悬液，并调整细胞浓度为5×1010/L。2、低温冻存采用含5％DMSO(二甲基亚砜，体积百分浓度)、3％HES(羟乙基淀粉，质量体积百分浓度)和4％HSA(人血白蛋白，质量体积百分浓度)的RPMI1640培养液作为细胞冷冻保护剂，在试管中将等体积的细胞冷冻保护剂(4℃预冷)缓慢加入细胞悬液(4℃预冷)中，边加边混匀，然后分装于2ml的冻存管中。在4℃冰箱中平衡30min后置于-80℃冰箱直接冻存，分别冻存0.5、1、3、6个月后42℃快速复温并检测各项指标。实验分为包被冻存组和常规冻存组，包被冻存组采用实施例1制备的γ聚谷氨酸包被冻存管，常规冻存组直接使用市售的常规冻存管。每组每个时间点设5个重复。3、指标检测有核细胞计数：用白细胞稀释液稀释细胞悬液后，血细胞计数板计数，重复3次取均值。流式细胞仪检测CD34+：取50μl有核细胞悬液，加入20μlFITC标记的抗CD34+抗体，阴性对照加入20μl鼠IgG1-FITC，避光室温孵育20min，用PBS洗3次，最后加0.5ml含0.1％多聚甲醛的PBS，上机分析。在FSC-SSC散点图上，以阴性对照设门(淋巴细胞群)，在FITC荧光参数直方图上设定阴性。分析软件为Cellquest。采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数：取0.5ml细胞悬液置于EP管，再加入约0.1ml0.5％台盼蓝染液，混合2min后制片，镜检。采用血细胞计数板计数，计算台盼蓝拒染率。应用SPSS11.0软件，采用单因素方差分析实验数据。二、实验结果包被冻存组和常规冻存组脐血造血干细胞冻存0.5、1、3、6个月后有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(％)见表1和图2。表1各指标检测结果(n＝5)表1和图2表明，包被有γ聚谷氨酸的冻存管对脐血造血干细胞具有冻存保护作用，在6个月冻存期间，其有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(细胞存活率)均没有显著变化。而使用常规无γ聚谷氨酸包被层的冻存管冻存脐血造血干细胞时，虽然0.5月、1月细胞数量和活性无明显下降，但是3月细胞数量和活性显著下降，6月下降更明显。因此，脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本专利技术提供的冻存管在-80℃冻存；超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。上述实施例的作用在于说明本专利技术的实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的实质和保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐血造血干细胞冻存管，包括冻存管主体，其特征在于：该冻存管主体的内壁设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。

【技术特征摘要】
1.一种脐血造血干细胞冻存管，包括冻存管主体，其特征在于：该冻存管主体的内壁设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。2.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞冻存管，其特征在于：所述γ聚谷氨酸的分子量为70万克/摩尔。3.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞冻存管，其特征在于：γ聚谷氨酸包被层的厚度为0.2-0.4mm。4.一种制备权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭守河，张康，
申请(专利权)人：南京九寿堂医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32