一种免疫细胞冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了免疫细胞冻存液及其应用，其中，该免疫细胞冻存液包含：2‑10体积％的DMSO；2‑15体积％的HSA；20‑88体积％的血浆，以及可选的加入白酒草皂苷R；以及余量培养基。该冻存液能够有效保存免疫细胞，并且保存时间长，细胞复苏后恢复能力强，细胞回收率高。

Immune cell frozen liquid and application thereof

The present invention discloses immune cell freezing medium and its application, which contains the liquid freezing immune cells: 2 10 vol% DMSO; 2 15 vol% HSA; 20 88 volume% of the plasma, and optionally adding liquor grass saponin R; and the remainder of the medium. The cryopreservation solution can effectively preserve the immune cells, and the storage time is long, and the recovery ability of the cells after recovery is strong, and the recovery rate of the cells is high.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞冻存液及其应用
本专利技术涉及一种免疫细胞冻存液及其应用，属于细胞培养领域。更具体地，涉及免疫细胞冻存液、用于冻存免疫细胞的试剂盒以及冻存免疫细胞的方法。
技术介绍
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好或战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复苏，导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。目前现有的细胞冻存液不能有效保存大规模培养的免疫细胞，冻存后的细胞复苏后细胞数量以及细胞活力都无法满足临床应用的标准，导致免疫细胞体外大规模培养后，必须短时间内尽快应用，否则就只能废弃。由此，适用于大量的免疫细胞的体外冻存液有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：DMSO是常用的细胞冷冻保存剂，单独使用保存免疫细胞存活率低。因而，专利技术人致力于寻找能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率的成分，以便与DMSO联用，以便通过其与DMSO协同作用，达到能够长期保存免疫细胞的效果。例如，专利技术人利用DMSO(二甲基亚砜，Dimethylsulfoxide)协同海藻糖对免疫细胞进行冷冻保存，发现细胞存活率明显下降，冷冻保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷冻复苏过程中能够调节渗透压，而血浆中又含有多种营养成分，因而，专利技术人尝试将血浆和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)与DMSO结合，制备免疫细胞的冻存液，结果发现，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。白酒草系菊科白酒草属植物Conyzajaponica(Thunb.)Less的全草，颜世伦等曾经报道从白酒草中分离得到化合物白酒草皂苷R，结构鉴定为3-O-β-D-glucopyranosylmedicagenicacid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosylester，其结构式为：本专利技术人还惊讶地发现，微量白酒草皂苷R，血浆和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)与DMSO结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低DMSO的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种免疫细胞冻存液。根据本专利技术的实施例，该冻存液包含2-10体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；20-88体积％的血浆；以及余量培养基。专利技术人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。因而，根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种免疫细胞冻存液。根据本专利技术的实施例，该冻存液包含0.2-0.8体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88体积％的血浆；以及余量培养基。专利技术人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。根据本专利技术的实施例，所述DMSO的浓度为10体积％。由此，对免疫细胞的冻存效果好。根据本专利技术的实施例，所述HSA的浓度为5体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且保证冻存液成本。根据本专利技术的实施例所述血浆的浓度为40体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力。根据本专利技术的实施例，所述血浆为自体血浆。根据本专利技术的实施例，所述培养基为1640培养基或Stemspan培养基。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。由此，冻存效果好。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种用于冻存免疫细胞的试剂盒，其包含前面所述的免疫细胞冻存液。专利技术人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存免疫细胞，且细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。根据本专利技术的又一方面，本专利技术还提供了一种冻存免疫细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法利用前面所述的免疫细胞冻存液或者试剂盒，冻存所述免疫细胞。专利技术人惊奇的发现，采用该方法冻存免疫细胞，细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。根据本专利技术的实施例，每106-109个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，能够有效实现免疫细胞的冻存，并且单位体积的冻存液保存的细胞量大，适宜大规模免疫细胞的冻存。根据本专利技术的具体示例，每107-108个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。根据本专利技术的实施例，进一步包括：将含有所述免疫细胞的所述免疫细胞冻存液或者所述的试剂盒进行程序降温处理，所述程序降温处理的条件为：0-2分钟，所述免疫细胞的温度从4摄氏度下降到-1摄氏度；2-3分钟，所述免疫细胞的温度从-1摄氏度上升到0摄氏度；3-6分钟，所述免疫细胞的温度保持0摄氏度；6-11分钟，所述免疫细胞的温度从0摄氏度下降到-10摄氏度；11-16分钟，所述免疫细胞的温度保持-10摄氏度；16-50分钟，所述免疫细胞的温度从-10摄氏度下降到-45摄氏度；50-85分钟，所述免疫细胞的温度保持-45摄氏度；85-95分钟，所述免疫细胞的温度从-45摄氏度下降到-90摄氏度；95-100分钟，所述免疫细胞的温度保持-90摄氏度。由此，通过程序降温避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。本专利技术的有益之处在于：本专利技术提出一种用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种免疫细胞冻存液。根据本专利技术实施例，该细胞冻存液冻存的细胞种类不受特别的限制，只要冻存液能用于长期保存细胞即可。根据本专利技术的实施例，该冻存液包含2-10体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；20-88体积％的血浆；以及余量培养基。专利技术人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于保存免疫细胞，并且冻存时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包含：2‑10体积％的DMSO；2‑15体积％的HSA；20‑88体积％的血浆；以及余量培养基。

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包含：2-10体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；20-88体积％的血浆；以及余量培养基。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的浓度为10体积％。3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述HSA的浓度为5体积％。4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述血浆的浓度为40体积％，任选地，所述培养基为1640培养基或Stemspan培养基。5.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。6.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。7.一种用于冻存免疫细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液。8.一种冻存免疫细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液或者权利要求7所述的试剂盒，冻存所述免疫细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐智峰，王辉，
申请(专利权)人：广州沙艾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44