干细胞的分化状态的判定方法以及该判定方法中使用的新的分化标记技术

本发明专利技术提供一种能够在分化初始阶段对未分化干细胞的分化状态进行判定的方法。本发明专利技术涉及一种细胞分化状态的判定方法，该方法对干细胞的FOXB2基因的表达进行检测并基于该检测结果进行判定；本发明专利技术还涉及一种分化标记，该分化标记选自FOXB2基因来源的mRNA或蛋白质。本发明专利技术能够应用于干细胞的品质管理、分化细胞的制备、分离方法中。进一步地，由于本发明专利技术能够在培养初始阶段对已分化的细胞进行判定，因此，在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理方面有用，能够有望缩短培养期间、降低培养基的成本。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞的分化状态的判定方法以及该判定方法中使用的新的分化标记
本专利技术涉及一种新的分化标记，其能够在分化的初始阶段判定干细胞的分化状态。
技术介绍
对于ES细胞(EmbryonicStemcell，胚胎干细胞)、iPS细胞(InducedPluripoentStemCell，诱导多能干细胞)等多能干细胞而言，为了维持其多能性，需要采用下述技术，例如，与饲养层细胞共同培养、用来自饲养层的条件培养基(CM)进行培养、对培养基添加碱性FGF(bFGF/FGF2，basicFibroblastGrowthFactor，碱性成纤维细胞生长因子)或LIF(leukemiainhibitoryfactor，白血病抑制因子)等。否则有时会因环境、细胞状态而丧失多分化能力，导致容易分化。因此，准确地获知干细胞的未分化状态(具备多能性的状态)、分化状态很重要。另外，在再生医疗领域中，在使多能干细胞分化为目标细胞后，再进行移植，但是，在进行该移植的细胞中混有未分化细胞时，可能导致肿瘤形成。鉴于此，对经分化诱导处理的多能干细胞中是否混有未分化干细胞进行判定的技术很重要。然而，难以根据细胞表观来判断细胞的分化状态。因此，作为判定多能干细胞的分化状态的方法，实施对作为分化状态的指标的标记进行检测的方法。例如，碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)、Nanog、Oct4、TRA-1-60、Sox、LIF-R等作为多能干细胞的多能性标记众所周知。多能干细胞在未分化状态下表达这些标记，因此，通过检测这些标记，能够判断干细胞是否维持未分化状态。然而，如果干细胞不处在已进行一定程度的分化的状态下(例如，截止至三胚层中的任意时期为止)，上述标记就不能判定分化状态。因此，在分化诱导后的分化初始阶段，难以判断未分化细胞是维持其未分化状态(多能性)，还是处于已获得未来进行分化的分化能力的状态。另一方面，已知被称作Fox(Forkheadbox)的具有叉头(forkhead)或翼螺旋(wingedhelix)DNA结合域的转录因子的一组(非专利文献1)，而且，已知其在人体内存在有约50种(FOXB1、FOXB2等)。虽然已知Fox的表达蛋白质主要作为生长调节因子、组织特异性调节因子、细胞周期调节因子而发挥作用，但是，作用基本上尚未阐明。现有技术文献非专利文献非专利文献1：EddyHvanRoon等.ClinicalEpigenetics2013,Jan16；5(1):2.doi:10.1186/1868-7083-5-2。
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的课题在于，提供一种能够在分化的初始阶段判定未分化干细胞的分化状态的方法。解决问题的技术方案本专利技术是为了解决上述课题而完成的，并且具有以下构成。(1)细胞分化状态的判定方法，其对干细胞中FOXB2基因的表达进行检测并基于该检测结果进行判定。(2)分化标记，其选自FOXB2基因来源的mRNA或蛋白质。众所周知的是，用添加有碱性FGF(bFGF,FGF2，basicFibroblastGrowthFactor，碱性成纤维细胞生长因子)的培养基对ES细胞、iPS细胞等未分化细胞进行培养时，该未分化细胞长期维持未分化状态并进行增殖。本专利技术人等为了解决上述课题进行了精心的研究，结果发现，使用未添加bFGF的培养基来培养iPS细胞时(分化诱导处理)，在开始培养后，经3～5天，检测出iPS细胞中FOXB2mRNA的表达，而且确认了其表达量显著增加的现象。另外，还确认了在使用添加有bFGF的培养基进行培养并维持未分化状态的iPS细胞中，未确认到FOXB2mRNA的表达。由此，发现FOXB2mRNA作为ES细胞、iPS细胞的分化标记很有用，而且，通过测定所述FOXB2mRNA的表达，能够筛选出处于分化初始阶段的细胞，从而完成了本专利技术。专利技术效果通过实施本专利技术的方法，能够在分化的初始阶段判定干细胞的分化状态。另外，本专利技术能够用于干细胞的品质管理、分化细胞的制备、分离方法中。进而，由于本专利技术能够在培养初始阶段判定分化的细胞，因此，本专利技术在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理方面很有用，能够有望缩短培养期间、降低培养基的成本。附图说明图1是在实施例1中得到的表示通过RT-PCR法检测hiPS细胞的FOXB2mRNA的表达的结果的电泳图。在图1中，分别示出了(1)FOXB2mRNA的表达的检测结果、(2)GAPDHmRNA的表达的检测结果、(3)OCT3/4mRNA的表达的检测结果、(4)NANOGmRNA的表达的检测结果、(5)SOX2mRNA的表达的检测结果。图2是在实施例2中得到的表示通过RT-PCR法研究FOXB2mRNA的表达的结果的电泳图。图3是在实施例3中得到的表示通过RT-PCR法研究FOXB2mRNA的表达的结果的电泳图。图4是在实施例4中得到的表示通过RT-PCR法研究的Foxb2mRNA的表达的结果的电泳图。图5是在参考例1中得到的使用未添加bFGF的培养基而培养的hiPS细胞的照片(图5(1))以及使用添加有bFGF的培养基而培养的hiPS细胞的照片(图5(2))。具体实施方式作为本专利技术的干细胞，可举出具有所谓的自我复制能力以及能分化成各种细胞的分化能力的细胞。例如，除了作为具有多分化能力(多能性)的未分化细胞的ES细胞、iPS细胞以外，还可举出ntES细胞(nucleartransferEmbryonicStemCell，核转移胚胎干细胞)、EG细胞(EmbryonicCell，胚胎生殖细胞)、EC细胞(EmbryonicCell，胚胎瘤干细胞)等。另外，作为干细胞所来源的动物，例如，可举出人、牛、马、狗、豚鼠、小鼠、大鼠等哺乳动物。作为用于本专利技术的细胞分化状态的判定方法中的受检细胞的干细胞，可举出经公知的分化诱导处理的干细胞、经维持未分化状态的处理的干细胞、经公知的多能性诱导处理而脱分化的体细胞等。作为对未分化干细胞进行分化诱导处理的方法，可采用已知的方法，没有特别的限定。例如，可举出在使用公知的分化诱导物质来处理细胞后对其进行培养的方法、使用不含有bFGF、LIF的培养基进行培养等在未分化干细胞被分化诱导的环境下进行培养的方法等。作为诱导未分化干细胞进行分化的化学物质(分化诱导物质)，已知：例如，诱导分化为神经细胞的维甲酸(RetinoicAcid)；诱导分化为心肌细胞的精胺(Spermine)、丁酸钠(SodiumButyrate)、曲古菌素A(TrichostatinA)；诱导小鼠ES细胞分化为胰岛素生成细胞的DNA甲基转移酶抑制剂(DNAMethyltransferaseInhibitor)等。“未分化状态”是指，例如，细胞处于具有上述自我复制能力以及能分化成各种细胞的分化能的状态。对于“维持未分化状态的处理”而言，例如，只要是公知的维持干细胞的未分化状态的处理即可，例如，可举出与饲养层细胞共培养、向培养基中添加bFGF、LIF的处理等。本专利技术的FOXB2基因是指，对用于判定的细胞所来源的动物物种中存在的FOXB2蛋白质进行编码的基因DNA、RNA等。另外，还包括对FOXB2蛋白质的同源物、突变体以及衍生物等进行编码的基因。进而，还包括在严格条件下与所述基因进行杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞分化状态的判定方法，其对干细胞的FOXB2基因的表达进行检测，并基于该检测结果进行判定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.20 JP 2014-1678001.一种细胞分化状态的判定方法，其对干细胞的FOXB2基因的表达进行检测，并基于该检测结果进行判定。2.如权利要求1所述的方法，其中，通过对FOXB2mRNA或FOXB2蛋白质进行检测来检测FOXB2基因的表达。3.如权利要求2所述的方法，其中，检测到FOXB2mRNA时，判定为所述细胞处于已分化的状态。4.如权利要求2所述的方法，其中，检测到FOXB2蛋白质时，判定为所述细胞处于已分化的状态。5.如权利要求2所述的方法，其中，FOXB2mRNA具有由序列号1或序列号34表示的碱基序列，或者与由序列号1或序列号34表示的碱基序列具有70％以上的同源性。6.如权利要求2所述的方法，其中，FOXB2mRNA对由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列进行编码，或者对该氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而成的氨基酸序列进行编码。7.如权利要求2所述的方法，其中，FOXB2蛋白质具有由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列，或者具有该氨基酸序列经一...

【专利技术属性】
技术研发人员：林田幸信，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP