以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗制造技术

技术编号:15340850 阅读:181 留言:0更新日期:2017-05-16 23:41
本发明专利技术提供了包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV‑9),以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂的重组疫苗,所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原,并替换腺病毒基因组非必需区,其中编码目的疾病的至少一种抗原并替换腺病毒基因组非必需区的至少一个外源核苷酸序列位于491和2782个核苷酸之间。该疫苗的载体对于工业规模生产是稳定的。同样地,即使当该疫苗与针对马立克氏病的疫苗组合施用时,两种疫苗产生不受彼此之间的干扰影响的足够的免疫应答。以相同的方式,重组疫苗的有效性不受母源抗体的影响,并且即使仅一次施用也能够诱导早期和持久的保护性应答。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗
本专利技术涉及基于病毒载体的疫苗,并且更特别地涉及基于血清型8禽腺病毒重组载体的疫苗。
技术介绍
腺病毒是线性、双链、DNA病毒,直径70-90nm,无包膜,并且具有二十面体形状的衣壳,所述衣壳由240个六邻体、12个五邻体和从每个二十面体顶点延伸的纤维形成。这些六邻体、五邻体和纤维代表主要腺病毒抗原,以及决定其血清型的那些。腺病毒基因组大小约为30-45kb,并且具有四个早期区(E1、E2、E3和E4)和五个晚期区(L1-L5)。腺病毒已分离自不同物种,两种主要属是分离自鸟的禽腺病毒属(Aviadenovirus)和分离自哺乳动物的哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。腺病毒视为用于疫苗生产的重组载体的良好候选物,因为它们是高度传染性的,并且其中许多不是致病性的。另外,腺病毒载体可有效地翻译大尺寸基因,并在动物中生成延长的免疫应答。然而,还已知腺病毒特异性结构需要研究每个物种的异源基因的具体插入位点,并且当转换成重组病毒载体时,实际上不可能概括出不同已知腺病毒的生物学行为。迄今为止,尤其是人、猿、禽、猪腺病毒已被用作可能用作重组疫苗的载体。特别地,已知禽腺病毒(FadV)是用于制备重组疫苗的潜在候选者。然而,如下所述,由于不能以所需稳定性达到其大规模生产,一般抑制了在商业水平上,特别是在兽医工业中成功利用它们的可能性,因为腺病毒的生产由细胞系进行,其产量通常非常差,或其性质阻止在连续传代中获得病毒载体的稳定性,由此很容易理解,现在在禽腺病毒中不存在载体化疫苗。例如,国际公开号WO94/24268描述了具有插入的至少一个异源核苷酸序列的FAdV重组载体,并且所述FAdV重组载体可用于在对疾病敏感的鸟类中生成免疫应答。根据该文件,可适合于待替换或插入的异源基因的腺病毒基因组的非必需区是位于基因组右末端处的那些,优选位于(97和99.9μ)中的0.0038和0.0039之间的区域。根据该文件,重组疫苗显然可与针对其他病毒的疫苗(例如马立克氏病或新城疫的那种)组合利用,而无这种的证据。另外,在该文件中,也未示出在用于大规模生产的细胞系中的连续传代后获得的腺病毒行为。此外,美国专利号6,296,852描述了血清型9FAdV载体(FAdV-9),在其中进行了核苷酸异源序列插入病毒基因组的非必需区。这些区域可以是位于基因组左端和/或右端的非编码区,优选在(60和100μ)中的0.0023和0.0039之间的位于右端(3')上的区域处。关于WO94/24268文件,尽管该专利鉴定了用于外源基因的潜在插入的另一个更宽的区域,但它未示出其在细胞系中连续传代之后的行为且特别是其完整性。在另一个文件中(Corredor,J.C.和Nagy,E.,thenon-essentialleftendregionofthefowladenovirus9genomeissuitableforforeigngeneinsertion/replacement.VirusResearch.第149卷,167-174;2010),公开了FAdV-9基因组的5'端非必需区也可以是用于通过外源基因插入或替换以产生重组载体的合适位点。例如,用编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的基因替换位于491-2782个核苷酸之间的非必需区,获得这样的载体之一。然而,该文件与其他文件一样,未显示当将编码疾病抗原的外源基因插入其中,并且通过在合适的细胞系统中复制它们以获得重组体疫苗时,所构建的病毒载体是否稳定,因为该文件仅显示了报道基因表达并缺乏体内测定;此外它没有提及组成或针对目的疾病的保护水平。如可见的,已知FAdV基因组的非必需区代表外源核苷酸序列可被插入或替换的潜在位点。然而,现有技术中描述的载体具有在以工业水平生产重组疫苗时不稳定的缺点,这是由于在细胞培养物中的不同传代后插入的异源基因的丧失。此外,在现有技术中,已避免了腺病毒载体在鸟类主要是家禽治疗中的用途,这是由于其干扰针对马立克氏病的疫苗,所述疫苗在禽类工业中广泛使用。马立克氏病(EM)是由影响驯养禽类的疱疹病毒引起的状况,引起引发腿或翅膀麻痹的淋巴增殖性疾病,和淋巴样肿瘤以及死亡。为了预防这种疾病,主要是皮下或卵内应用单价或多价活性疫苗。为了降低成本并在施用时达到更高的效率,有时优选至少两种疫苗的联合施用。然而,尽管如上述国际公开号WO94/24268的文件揭示了利用与马立克氏病疫苗组合的腺病毒的可能性;但后续研究已证明,当分析死亡率和由两种疾病对鸟类(如商业性母鸡)产生的病变(优选长期)时,腺病毒疫苗和马立克氏病毒疫苗具有严重的场内干扰。目前,现在已知通过同时应用针对EM的全病毒疫苗与在腺病毒载体中的重组疫苗,针对EM的疫苗可能由于下述机制而干扰重组疫苗:a)不同的复制动力学;b)疫苗竞争相同的细胞类型用于其在鸟类中的复制;和c)EM病毒在鸟类中引起免疫抑制。显然,如果要克服这种干扰并且为了实现针对与重组疫苗的外源基因相关的疾病的有效疫苗接种,则有必要施用更高剂量的所述重组疫苗或降低针对EM的疫苗的剂量(Breedlove等人,Avianinfluenzaadenovirus-vectoredin-ovovaccination;targetembryotissuesandcombinationwithMarek'sdiseasevaccine.AvianDisease.第55卷,667-673;2011)。然而,同样的Breedlove等人的参考文献显示,增加腺病毒重组疫苗的剂量可引起对针对EM的疫苗的暂时干扰,这使得其无效,在该领域中引起严重的问题。这意味着,迄今为止,基于重组腺病毒病毒载体的疫苗无法用不干扰由马立克氏病疫苗赋予的保护的外源基因配制,或反之亦然。同样地,母源抗体是可潜在地引起对疫苗干扰的另一种因素。虽然母源抗体赋予对新生动物的保护,但是它们的存在可抑制或降低疫苗效应,造成由此产生的免疫应答是非最佳的。一般在疫苗开发中发现的另一个挑战是根据用于疫苗的配方,其中实现保护和所述保护的持续时间。赋予早期保护,即,在从应用开始的极短时间内的保护的疫苗,也将具有短期效应,因为保护水平将迅速下降,使得需要定期再次接种疫苗。相比之下,赋予持久或长期保护的疫苗将需要更多的时间来实现保护(晚期保护),尽管所述保护将持续更长的时间,通常需要较少的再次接种疫苗以实现所需的保护效应。通常,为了在一组动物中实现持久保护,有必要应用早期保护疫苗与晚期保护疫苗的组合,以避免动物在其整个发育过程中生病的可能性。在现有技术中,已知活性病毒疫苗通常赋予快速或早期保护,因为其在从其应用开始的短时间范围内实现可接受的但不持久的保护水平。另一方面,还已知灭活的病毒疫苗赋予比活性病毒更持久的保护,但不需要长时间来实现它,即,保护很迟,并且在许多情况下它们也需要再次接种疫苗,虽然较不频繁。例如,Stine等人(Evaluationofinactivatednewcastledisease,aviandiseases,第24卷,第1期(1980年1月-3月),第99-111页)评价了针对NDV的三种疫苗:乳液中的灭活疫苗、Al(OH)3中吸附的灭活疫苗和活的商业疫苗本文档来自技高网...
以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗

【技术保护点】
一种重组疫苗,所述重组疫苗包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV‑9),以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂,所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原,并替换腺病毒基因组非必需区,其特征在于所述外源核苷酸序列位于491和2782个核苷酸之间。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.08 WO PCT/IB2014/0638091.一种重组疫苗,所述重组疫苗包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9),以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂,所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原,并替换腺病毒基因组非必需区,其特征在于所述外源核苷酸序列位于491和2782个核苷酸之间。2.根据权利要求1所述的重组疫苗,其中所述FAdV-9载体是活的(活性的)或灭活的。3.根据权利要求1所述的重组疫苗,其中所述FAdV-9载体包含序列SEQIDNO:1。4.根据权利要求1所述的重组疫苗,其中所述外源核苷酸序列编码选自以下的目的疾病的至少一种抗原:禽流感、具有包涵体的肝炎、禽传染性喉气管炎、新城疫、法氏囊感染、传染性支气管炎、由偏肺病毒(MPNV)引起的疾病、马立克氏病、禽传染性贫血或其大小允许插入所述FAdV-9载体的任何其他基因(gen)。5.根据权利要求4所述的重组疫苗,其中所述外源核苷酸序列编码包含以下的组的抗原:禽流感病毒的血凝素(HA);包涵体肝炎病毒,血清型4和8的纤维和六邻体;禽传染性喉气管炎病毒(LTI)的糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD);新城疫病毒的HN和F蛋白;法氏囊的VP2蛋白病毒感染;传染性支气管炎病毒的S1和S2蛋白;偏肺病毒(MPNV)的F蛋白;以及禽传染性贫血的VP1、VP2和VP3蛋白。6.根据权利要求5所述的重组疫苗,其中所述禽流感病毒的HA选自所述蛋白质的H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亚型中的至少一种。7.根据权利要求1所述的重组疫苗,其中所述外源核苷酸序列包含编码与用作病毒载体的所述FAdV-9不同的禽腺病毒的至少一种抗原的基因。8.根据权利要求1所述的重组疫苗,其中为了实现抗原应答所需的病毒浓度为至少105.0DICC50%/剂量。9.根据权利要求8所述的重组疫苗,其中为了实现所述抗原应答所需的病毒浓度为至少106.0DICC50%/剂量。10.根据权利要求2所述的重组疫苗,其中当所述疫苗是活的(活性的)时,所述药学上可接受的媒介物是水性溶液,优选选自包含TPGA稳定剂(海藻糖、磷酸盐、谷氨酸盐、白蛋白)的水性溶液;包含蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员:B·洛扎诺杜伯纳德E·索托普里安特D·萨法蒂米兹拉西
申请(专利权)人:皮卡里奥工业集团股份公司
类型:发明
国别省市:墨西哥,MX

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