BAX靶向二聚化以调节BAX活性制造技术

技术编号:15340834 阅读:232 留言:0更新日期:2017-05-16 23:41
提供了鉴别试剂的方法,所述试剂通过促进或干扰BCL‑2相关x蛋白(BAX)的二聚化来直接调节BAX。还提供了通过影响二聚化来直接调节BAX的试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】BAX靶向二聚化以调节BAX活性相关申请的交叉引用本申请要求2014年5月30日提交的美国临时专利申请号62/005,013的权益,所述美国临时专利申请的内容以全文引用方式并入本文。政府利益声明本专利技术是在由国家心肺和血液研究所(NationalHeart,Lung,andBloodInstitute)颁发的基金号5R00HL095929下由政府支持进行的。政府在本专利技术中具有某些权利。
技术介绍
专利技术背景贯穿本申请,各种出版物由括号中的数字指代。这些参考文献的完整引用可在说明书的结尾处找到。本文提到的这些出版物以及所有专利、专利申请公布和书籍的公开特此以全文引用方式并入本申请,以更充分描述本专利技术从属的领域。程序性细胞死亡或细胞凋亡是调控细胞生存和死亡之间关键平衡的基本过程(1)。细胞凋亡失调导致正常内稳态失衡,促成诸如癌症和神经变性的疾病(2,3)。细胞凋亡失调是包括癌症、心血管疾病和神经变性疾病的若干高死亡率人类疾病的关键。蛋白质的BCL-2家族包括调控细胞在线粒体途径处定型向凋亡的复杂相互作用网络(4,5)。BCL-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白二者。促凋亡BCL-2蛋白—BCL-2相关X蛋白(BAX)和BCL-2同源拮抗物杀伤物(BAK)—诱导线粒体外膜透化并且代表线粒体凋亡的关键守门因子(gatekeeper)和效应因子。因此,促凋亡BAX或BAK的抑制损害在包括心肌细胞和神经元的终末分化细胞中引发过早或不需要的细胞死亡的细胞能力。此外,BAX或BAK的激活促进凋亡并且可克服肿瘤细胞对经受细胞死亡的抗性和封闭性。促凋亡BAX是在非凋亡细胞的细胞溶质中占主导的BCL-2家族(4,5)的关键效应因子成员(6)。在激活后,BAX从细胞溶质移位至线粒体以执行线粒体外膜的透化并且将凋亡因子(apoptogen)释放入细胞溶质(7,8),这是线粒体功能障碍和凋亡的“不可返回点”(“pointofnoreturn”)(9,10)。促凋亡BAX是高度受调控的蛋白,其与触发或抑制其激活的促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白相互作用。诸如BCL-2和BCL-XL的抗凋亡BCL-2蛋白直接抑制激活的BAX,而诸如BIM和BID的促凋亡BCL-2蛋白亚组使用它们的BH3结构域直接触发BAX激活。BAX的细胞溶质构象具有位于其结构的N末端表面的BH3触发位点。BAX与钉合(stapled)BIMBH3螺旋经过N末端触发位点(螺旋α1/α6)的相互作用导致涉及一系列构象变化的BAX激活。这些构象变化包括α1-α2环从封闭构象置换至开放构象以及α2(BH3结构域)和α9螺旋从疏水核心活动化以允许线粒体移位和寡聚化,从而导致线粒体透化。尽管在理解BAX激活上已有显著进展,当前关于BAX调控机制的知识是有限的。仅理解了激活的BAX是如何通过BAXBH3结构域与抗凋亡BCL-2蛋白的BH3沟相互作用而抑制的。然而,已经报道了众多抑制细胞溶质BAX的蛋白,并且已研究了稳定BAX的细胞溶质形式的翻译后修饰。出现的数据表明在不需要BAX激活的情况下,BAX在细胞溶质与线粒体区室之间具有高度动态的定位。然而,不存在细胞溶质BAX如何保持在控制之下的结构证据或任何机制理解。当前的知识局限于完整BAX的结构,完整BAX的NMR结构表明其α9构象使蛋白保持无活性细胞溶质形式,从而防止蛋白移位至线粒体膜。最近的研究报道了除全长BAX结构的N末端表面处的激活位点以外,在缺少C末端螺旋α9的截短结构中揭示的第二激活位点,所述截短结构可能模拟BAX的线粒体连接形式(11-14)。虽然BAX激活的早期步骤已确定,但仍缺乏使BAX在细胞溶质中保持在控制之下以及调控BAX激活和移位至线粒体外膜的机制的理解。此外,在细胞溶质中和激活过程中BAX采用的构象对于理解BAX介导性凋亡和BAX可如何被药物靶向是关键的。因此,BAX和调控BAX激活的蛋白,包括其它BCL-2家族成员,是针对开发新颖疗法的集中研究和药物发现活动的靶标(15,16)。通过BAX调节细胞死亡可在若干疾病中具有治疗益处。与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、或表达或功能的疾病包括:心血管疾病和病症(例如,动脉硬化、心力衰竭、心脏移植、动脉瘤、慢性肺病、缺血性心脏病、高血压、血栓形成、心肌病),神经变性疾病和神经障碍(例如,阿尔茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病、亨廷顿(Huntington)氏病、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩、各种形式的小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症),免疫病症(例如,器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、炎性肠病、克劳恩(Crohn)氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病),缺血(例如,中风、心肌梗塞和再灌注损伤),不育症(例如,过早绝经、卵巢衰竭或卵泡闭锁),血液病症(例如,范可尼(Fanconi)贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性白细胞减少症、脊髓发育不良),肾缺氧,肝炎,哮喘和AIDS。然而,当前不存在通过直接调节BAX活性来阻止或激活细胞死亡的小分子疗法。存在凋亡途径的抑制剂,诸如在各种细胞中阻止细胞死亡的半胱天冬酶抑制剂。然而,半胱天冬酶抑制剂在细胞中可得到的不同半胱天冬酶间缺乏特异性,这是对于其成功临床应用的不利因素。BAX的直接激活剂可具体应用于癌症治疗中,并且可选择性地克服癌症细胞的抗凋亡抗性并使正常细胞免受伤害。同样地,可应用BAX的直接激活剂以在与免疫细胞不受控产生相关联的自身免疫疾病中促进凋亡。BAX抑制剂可具体应用于细胞死亡异常过度的心脏病、CNS障碍疾病以及肝和肾病。本专利技术解决对鉴别用于治疗性处理的BAX抑制剂和激活剂的需要。
技术实现思路
本专利技术公开了用于鉴别干扰或促进BAX二聚化、和/或结合至先前未鉴别出的BAX二聚体结合位点的试剂的测定方法。本专利技术还提供促进或干扰二聚化的试剂。提供了鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:(a)使试剂与BCL-2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触,以及(b)测量试剂是否抑制或促进BAX二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX二聚化,其中抑制BAX二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;并且其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX二聚化,其中促进BAX二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。还提供了用于鉴别调节BAX活性的试剂的方法,所述方法包括:在试剂存在和缺少时,使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触;以及测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合,其中相比于试剂缺少时的结合,在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。提供了由以下组成的肽:a)TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQIDNO:11),b)TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQIDNO:12),c)TWQTVTIFVAGVLTA(SEQIDNO:13),d)TWQTVTIFVAGVL(SEQIDNO:14),e)包含序列TXQTXXIFXAG(SEQIDNO本文档来自技高网
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BAX靶向二聚化以调节BAX活性

【技术保护点】
一种鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:(a)使试剂与BCL‑2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触,以及(b)测量试剂是否抑制或促进BAX的二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX的二聚化,其中抑制BAX的二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;以及其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX的二聚化,其中促进BAX的二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.30 US 62/005,0131.一种鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:(a)使试剂与BCL-2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触,以及(b)测量试剂是否抑制或促进BAX的二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX的二聚化,其中抑制BAX的二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;以及其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX的二聚化,其中促进BAX的二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。2.如权利要求1所述的方法,其中所述试剂结合至BAX的N末端结合位点和/或C末端结合位点的氨基酸残基。3.如权利要求1所述的方法,其中试剂在结合位点残基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、I133、R134、T135、I136、M137、G138、W139、T140、L141、D142、F143、L144、R145、E146和R147中一处或多处结合至BAX的N末端。4.如权利要求1所述的方法,其中试剂在结合位点残基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、I187、W188、K189K190、M191和G192中一处或多处结合至BAX的C末端。5.如权利要求1-4中任何项所述的方法,其中对二聚体或单体形式的BAX的测量是使用荧光偏振测定法、尺寸排阻层析(SEC)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和特异性结合BAX二聚体或BAX单体的抗体中的一者或多者来进行的。6.一种用于鉴别调节BAX的活性的试剂的方法,所述方法包括:在试剂存在和缺少时,使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触;以及测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合,其中相比于试剂缺少时的结合,在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。7.如权利要求6所述的方法,其中试剂是BAX的抑制剂。8.如权利要求6或7所述的方法,其中BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQIDNO:11)。9.如权利要求6-8中任何项所述的方法,其中BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端结合位点固定在固体基质上。10.如权利要求6-9中任何项所述的方法,其中BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合使用荧光测定法来测量。11.如权利要求1-10中任何项所述的方法,其中BAX是人BAX。12.如权利要求1-11中任何项所述的方法,其中试剂是小分子、分离肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或组合的肽基试剂、烃钉合肽、限制性肽、大环、类肽、模拟肽、折叠体、适体、抗体、单抗体、纳米抗体或它们的组合。1...

【专利技术属性】
技术研发人员:E·加瓦蒂奥斯
申请(专利权)人:阿尔伯特爱因斯坦医学院公司
类型:发明
国别省市:美国,US

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