一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法技术

本发明专利技术属于检测分析技术领域，具体涉及一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，该方法具体通过以下步骤实现：取蓝莓成熟果实的果皮，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇‑0.15%甲酸水‑环己六醇，超声波震荡，置于‑15℃下保存，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提，离心，收集上清液；将上清液装入玻璃层析柱的活化完全的大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，蒸发至浸膏状，用甲醇‑0.1%甲酸水溶液复溶并定容，过滤；将滤液采用超高效液相色谱‑质谱法进行分析检测。本发明专利技术对对流动相、洗脱程序、色谱柱等条件进行了筛选和优化，选用的方法重复性及稳定性好；能够快速准确的对蓝莓中的花青苷类物质进行定性及定量检测，检出限低。

Method for detecting and analyzing anthocyanin in Blueberry

The invention belongs to the technical field of detection, and particularly relates to a method for detection and analysis of blueberry anthocyanin substances, the specific method is realized by the following steps: Taking blueberry fruits, and after grinding in liquid nitrogen, placed in the centrifuge tube, adding methanol 0.15% formic acid water cyclohexyl alcohol six, ultrasonic vibration. At 15 DEG C preservation, remove the recovery to room temperature, and then placed in 4 DEG C, extraction, centrifugation, supernatant was collected; the activation of macroporous resin complete supernatant into glass chromatography column for purification elution, the eluate was evaporated to extract, methanol 0.1% aqueous formic acid solution and constant volume the filtrate by, filtration; mass spectrometry UPLC analysis detection. The invention of the mobile phase, were screened and optimized elution chromatographic column and other conditions, the method repeatability and good stability; can quickly and accurately on the blueberry anthocyanins substance for qualitative and quantitative detection, low detection limit.

【技术实现步骤摘要】
一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法
本专利技术属于检测分析
，具体涉及一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法。
技术介绍
蓝莓(Blueberry)属杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，是一种新兴果树，富含花青素、熊果酸、黄酮等抗氧化物质，具有改善视力、增强记忆力、软化血管、抗癌等多种功能，倍受消费者的青睐，具有广阔的发展前景。蓝莓果实的抗氧化活性主要决定于其含有丰富的花青苷类物质。因此，蓝莓中花青苷的含量是决定其品质的重要因素之一。花青苷是一种广泛存在于植物体中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，在植物体内主要呈现蓝色、紫色和红色。目前国内外关于花青苷的研究主要集中在分离、鉴定、生物合成机理和保健功能研究等方面。关于花青苷的检测方法，目前常用紫外可见分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法。其中，高效液相色谱串联质谱法相比较其它方法在快速分离、准确定性和灵敏度等方面更具有优势。党娅等人（中国调味品，第40卷第5期：76-81）公开了一种蓝莓花青苷提取及组分分析研究，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法对蓝莓中花青苷进行分析，但仅检测到四种组分，优势不明显。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，本专利技术以蓝莓成熟果实为研究对象，建立起UPLC-MS/MS测定方法，利用多重反应监测模式对蓝莓果实中花青苷组分进行定性和定量分析，旨在为蓝莓的品质评价和优异种质挖掘提供科学依据。本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，包括以下步骤：（1）取1-2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇15mL，超声波震荡10min后，首先置于-15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1%甲酸水溶液复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；（3）将滤液采用超高效液相色谱-质谱法进行分析检测。进一步的，步骤（1）中，所述甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇的体积比为2:8:5。进一步的，所述大孔树脂为HPD-45A。上述大孔树脂采用的活化方法为：首先将大孔树脂在质量浓度为15%的氯化钠溶液中浸泡5min，然后置于质量浓度为8%的氯化钠溶液中浸泡2min，蒸馏水冲洗，再用体积分数为95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无味，再用5%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5%盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用蒸馏水浸泡即可。进一步的，步骤（2）中，所述蒸发的温度为30℃。进一步的，步骤（2）中，所述甲醇-0.1%甲酸水溶液的体积比为2:8。本专利技术所使用的超高效液相色谱-质谱法中色谱柱为PhenomenexKinetex:100mm×4.6mm，2.6μm，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱。进一步的，所述梯度洗脱的条件为：0-1min,5%B；1-2.5min，5%-50%B；2.5-3.8min，50%-70%B；3.8-5.0min，70%-90%B；5.0-6.0min，90%B；6.0-6.2min，90%-5%B；6.2-8min，5%B；采用阀切换功能：0-0.5min切入废液，0.5-4.5min切入质谱，6.0-8min切入废液。上述质谱法的条件为：气帘气CUR:35.00；离子源电压IS:5500.00；离子源温度TEM:550.00；离子源电离反应气体GS1:55.00；脱溶剂气体GS2:55.00；碰撞池气体CAD:7.00。本专利技术专利技术人经过大量实验发现，在蓝莓提取过程中，通过少量加入环己六醇，能够提高花苷类物质的提取率，环己六醇能够抑制蓝莓中糖苷酶、多酚氧化酶的活性，从而提高提取物质的稳定性，同时，多种溶剂混合作用下，能够起到表面活性剂作用，降低其表面张力，从而提高提取率。本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术对对流动相、洗脱程序、色谱柱等条件进行了筛选和优化，选用的方法重复性及稳定性好；（2）能够快速准确的对蓝莓中的花青苷类物质进行定性及定量检测，检出限低。附图说明图1为蓝莓提取液中的花青苷Q1扫描质谱图。图2为矢车菊-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图3为矢车菊-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图4为芍药素-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图5为芍药素-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图图6为飞燕草-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图7为矢车菊3-木糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图8矢车菊3-槐糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图9为牵牛花素3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图10为飞燕草素-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图。图11为不同溶剂提取蓝莓中花青苷类物质的效果图。具体实施方式为便于理解
技术实现思路
，下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例1一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，包括以下步骤：（1）取1-2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇15mL(所述甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇的体积比为2:8:5)，超声波震荡10min后，首先置于-15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的HPD-450A大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，在30℃下蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1%甲酸水溶液（甲醇-0.1%甲酸水溶液的体积比为2:8）复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；所述大孔树脂采用的活化方法为：首先将大孔树脂在质量浓度为15%的氯化钠溶液中浸泡5min，然后置于质量浓度为8%的氯化钠溶液中浸泡2min，蒸馏水冲洗，再用体积分数为95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无味，再用5%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5%盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用蒸馏水浸泡即可；（3）将滤液采用超高效液相色谱-质谱法进行分析检测。所述超高效液相色谱-质谱法中色谱柱为PhenomenexKinetex:100mm×4.6mm，2.6μm，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0-1min,5%B；1-2.5min，5%-50%B；2.5-3.8min，50%-70%B；3.8-5.0min，70%-90%B；5.0-6.0min，90%B；6.0-6.2min，90%-5%B；6.2-8min，5%B；流速为1.0ml/min；进样量为5μl；采用阀切换功能：0-0.5min切入废液，0.5-4.5min入质谱，6.0-8min切入废液；所述质谱法的条件为：气帘气CUR:35.00；离子源电压IS:5500.00；离子源温度TEM:550.00；离子源电离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取1‑2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇‑0.15%甲酸水‑环己六醇15mL，超声波震荡10min后，首先置于‑15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，蒸发至浸膏状，用甲醇‑0.1%甲酸水溶液复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；（3）将滤液采用超高效液相色谱‑质谱法进行分析检测。

【技术特征摘要】
1.一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取1-2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇15mL，超声波震荡10min后，首先置于-15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1%甲酸水溶液复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；（3）将滤液采用超高效液相色谱-质谱法进行分析检测。2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇的体积比为2:8:5。3.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述大孔树脂为HPD-45A。4.根据权利要求3所述的检测分析方法，其特征在于，所述大孔树脂采用的活化方法为：首先将大孔树脂在质量浓度为15%的氯化钠溶液中浸泡5min，然后置于质量浓度为8%的氯化钠溶液中浸泡2min，蒸馏水冲洗，再用体积分数为95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无味，再用5%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5%盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用蒸馏水浸泡即可。5.根据权利要求1所述的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏海蓉，刘庆忠，易锡斌，陈新，谭钺，宗晓娟，徐丽，朱东姿，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37