一种酚传感器的生物电极的制备方法技术

一种酚传感器的生物电极的制备方法，涉及电化学生物传感器领域，将具有较大疏水性的疏水链段和具有电荷的亲水链段的两亲型嵌段共聚物溶于有机溶剂中配成溶液，再将溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发后即可制得生物电极，该生物电极可用于酚类物质的检测。采用本发明专利技术方法制备出电化学生物传感器检测限低、灵敏度高、稳定性好、适用性广、制作简单，蛋白质分子和载体材料用量少。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，在医学、食品、环境等领域运用广泛，具有较高的经济效益。

Method for preparing biological electrode of phenol sensor

Preparation method of biological electrode for phenol sensor, relates to the field of electrochemical biosensors, will have two Pro type hydrophobic segment larger hydrophobic and hydrophilic segments with charge of block copolymer dissolved in an organic solvent solution, then the solution is coated on the surface of the electrode with semi dry protein aqueous solution then, under the constant temperature and humidity box, to be after the volatilization of solvent and water prepared by bio electrode, the electrode can be used for biological detection of phenols. The electrochemical biosensor made by the method of the invention has low detection limit, high sensitivity, good stability, wide applicability and simple manufacture, and the amount of protein molecules and carrier materials is less. A biosensor with different functions can be prepared by using the same fixed material, which is suitable for the detection of various substances, and is widely used in medicine, food, environment and other fields, and has high economic benefit.

【技术实现步骤摘要】
一种酚传感器的生物电极的制备方法
本专利技术涉及电化学生物传感器制备

技术介绍
电化学生物传感器由于体积小、分析速度快、选择性高等优点在发酵工艺、食品工程、环境监测、临床医学、军事及军事医学等方面已经得到高度重视和广泛应用。它通常是基于由生物分子催化产生或消耗的电子的氧化还原反应，在发生氧化还原反应时在被检测物、生物电催化活性分子和电极之间会发生电子的传递。由法拉第定律可知，氧化还原反应的摩尔数与转移的电量是呈正比的，因此可以通过测定电子转移时产生的电流大小来测定被检测物质的浓度。由于酶的催化具有选择性高，催化效率高等特性，可以采用适当的方法将所需要的生物活性分子加以修饰并固定到电极的表面，就可以用于分子识别，有选择性的进行测定。其中分子识别部分是电化学生物传感的核心。蛋白质分子在生物体中大量存在，如大部分酶、部分激素、抗体、部分抗原、细胞色素C、血红蛋白和肌红蛋白、干扰素等。现有的常用于蛋白质分子的固定方法主要有吸附、交联、共价键合、包埋等，固定材料有无机材料、高分子材料等，各种方法都有其适宜的使用范围和优缺点，但有一个相同点，就是都会牺牲掉一部分蛋白质的活性。以生物电极为敏感元件的电化学生物传感器是以电信号的传导来实现传感功能的，其中生物界面膜的构筑是制备电化学生物传感器的关键步骤。因此创新生物界面膜的构筑方法以提高电化学生物传感器测量的准确度、灵敏度、稳定性、选择性等是科研工作者的主要目标之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、检测限低、稳定性和重现性好、选择渗透性好的方法用以固定多酚氧化酶来制备酚传感器的生物电极。本专利技术的技术方案是：将两亲型嵌段共聚物溶于溶剂中配成两亲型嵌段共聚物溶液，再将两亲型嵌段共聚物溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发，得到酚传感器的生物电极。所述两亲型嵌段共聚物的分子量为5000～500000；所述两亲型嵌段共聚物中的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团；所述两亲型嵌段共聚物中的疏水链段为在水溶液中不易降解的疏水性聚合物链段；所述溶剂为易挥发且与水不互溶的有机溶剂。由于两亲型嵌段共聚物的分子量必须达到一定值，否则自组装的驱动力不够，因此本专利技术采用分子量为5000～500000。由于两亲型嵌段共聚物的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团，而蛋白质为两性物质，其所带电荷可以通过水溶液的pH值来调节，这样就可以使其与带有电荷的两亲型嵌段共聚物发生静电吸附以诱导生物分子的有序排列，因此其对蛋白质分子的吸附能力可以大大提升。并且在高湿度的环境下，随着铸膜液中的有机溶剂挥发，表面温度急剧下降，高湿度氛围中的水蒸气大量冷凝在电极表面。聚合物在亲水/疏水的平衡作用下凝结在水滴表面，随着挥发完毕，温度回升，电极表面就自组装形成了六角形的花样。而粗糙表面利于蛋白质分子的附着，而大小可控的孔径也可使得电极的响应具有更短的时间和更高的选择性。因此用该电荷-亲疏水双驱动自组装法可构筑性能优良的生物活性膜和高稳定、高灵敏度、高选择性的电化学生物传感器。采用本专利技术方法制备出传感器检测限低、灵敏度高、稳定性好、选择渗透性好，适用性广、制作简单，蛋白质分子和载体材料用量少，适宜大规模批量生产。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，在医学、食品、环境等领域运用广泛。另外，本专利技术所述带有电荷的基团为吡啶基。优选的两亲型嵌段共聚物为聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶。聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶是一种聚电解质型两亲性嵌段共聚物，其中聚苯乙烯链段为疏水链段，而聚4-乙烯基吡啶为亲水链段且可以在一定条件下产生电离（pKa=9.2）；而多酚氧化酶的pI=4.7-5；因此在pH=6.0时PS-b-P4VP的亲水链段带正电，多酚氧化酶带负电。在电荷亲疏水双驱动自组装过程中，两者相互产生静电作用，从而得到生物分子有序排列的生物界面。本专利技术优选的溶剂为氯仿。溶解度参数是衡量聚合物和溶剂是否能够很好互溶的一个重要指标，氯仿的挥发速度较快，且与水不互溶，是在电极上构筑多孔膜的理想溶剂。水的溶解度参数（δH2O）=47.3J1/2·cm-3/2，δCHCl3=19.0J1/2·cm-3/2。因而氯仿是PS-b-P4VP的良溶剂。所述两亲型嵌段共聚物溶液中，两亲型嵌段共聚物占溶液质量的0.05%。否则无规线团易互相缠结，构象转换势垒过大，自组装难以进行。所述恒温恒湿箱内的温度为25℃，湿度为80%RH。实验发现在15～40℃的温度范围之间，酶电极的响应电流随温度升高而增大，在40℃左右出现最大响应电流，随着温度的继续升高，响应电流开始逐渐下降。但实验也发现PPO从30～35℃开始就会很快变性。而且在实际应用中25℃是最方便和最常见的，因此选择25℃。实验对湿度的要求较高，湿度为80%RH时，在恒温恒湿箱中干燥快，超过半小时即可。所述蛋白质的分子为多酚氧化酶。多酚氧化酶是一个四聚体，包含四个铜离子，由两个芳香族化合物及氧相连。多酚氧化酶是一种可以形成两种或两种以上不同形式的均聚物的蛋白，它通常以单体，三聚体，四聚体，八聚体形式存在。多酚在氧的存在下，氧气会分两步催化邻苯二酚的，先是将苯酚邻位氧化，然后将邻位双酚氧化为邻醌，在反应过程中有电子转移，固定化PPO所得到的生物传感器在恒电位下可以将酚类物质的浓度与电流信号相关联。附图说明图1为改变多酚氧化酶的用量得到的感应电流图。图2为改变铸膜液的用量得到的感应电流图。图3为改变pH得到的感应电流图。图4为改变扫描电压得到的感应电流图。图5为温度对PS-b-P4VP/PPO响应电流的影响。图6为温度的倒数与电流密度的对数的关系图。图7为响应电流阶梯曲线图。图8为图7的局部放大图。图9为PS-b-P4VP/PPO电极对儿茶酚的浓度校正曲线。图10为PS-b-P4VP/PPO电极对儿茶酚的线性范围图。图11为PS-b-P4VP/PPO电极对不同酚类物质的浓度校正曲线。图12为PS-b-P4VP/PPO电极的长期稳定性图。具体实施方式一、制备生物电极：1、采用聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶（PS-b-P4VP）两亲型聚合物与氯仿配制成浓度为0.05%的溶液。2、将多酚氧化酶溶解在pH为6.0的1mM的磷酸缓冲溶液中。3、将多酚氧化酶的溶液均匀的滴涂在铂碳电极表面，待溶剂蒸发至快干后，再滴涂两亲型嵌段共聚物的氯仿溶液。4、滴涂结束后，立即将电极置于温度为25℃，湿度为80%RH的恒温恒湿箱中。5、待溶剂和水挥发，形成干燥表面，即制得生物电极，再将生物电极放在冰箱中冷藏，待用。本例中，多酚氧化酶(1mg·mL-1)的用量为6μg、PS-b-P4VP的体积为7μL。传感器使用的最佳条件是：测量温度25℃、工作电位是-200mV、溶液pH为6.0。二、制备传感器：将以上制成的生物电极制成传感器，该生物传感器响应快、灵敏度高、线性范围广、检测限低。其对儿茶酚的灵敏度314mA·M-1·cm-2，线性检测范围为0.12~30μM，检出限为0.07μM；固定化多酚氧化酶的酶催化反应的表观活化能是18kJ/mol。该传感器可以用于多种酚类的检测，对不同酚的检测灵敏度顺序为：苯酚>儿茶酚>本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于将两亲型嵌段共聚物溶于溶剂中配成两亲型嵌段共聚物溶液，再将两亲型嵌段共聚物溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发，得到酚传感器的生物电极；所述两亲型嵌段共聚物的分子量为5000～500000；所述两亲型嵌段共聚物中的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团；所述两亲型嵌段共聚物中的疏水链段为在水溶液中不易降解的疏水性聚合物链段；所述溶剂为易挥发且与水不互溶的有机溶剂。

【技术特征摘要】
1.一种酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于将两亲型嵌段共聚物溶于溶剂中配成两亲型嵌段共聚物溶液，再将两亲型嵌段共聚物溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发，得到酚传感器的生物电极；所述两亲型嵌段共聚物的分子量为5000～500000；所述两亲型嵌段共聚物中的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团；所述两亲型嵌段共聚物中的疏水链段为在水溶液中不易降解的疏水性聚合物链段；所述溶剂为易挥发且与水不互溶的有机溶剂。2.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述带有电...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天奕，郭腾，徐嘉琪，成国兴，薛怀国，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32