一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱由8对SSR标记组成。构建方法包括：(1)菌丝培养；(2)基因组DNA的提取；(3)SSR分子标记的检测；(4)电泳检测。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇L9015菌种。本发明专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，利用本发明专利技术构建的L9015菌种SSR指纹图谱，在收集的40个历年来我国香菇主要栽培品种中具有专一性。

SSR labeled fingerprint of letinous edodes L9015 strain and construction method and application thereof

The invention relates to a SSR labeled fingerprint of a letinous edodes L9015 strain and a construction method and an application thereof, wherein the fingerprint is composed of 8 pairs of SSR markers. The construction methods include: (1) Mycelium Culture; (2) extraction of genomic DNA; (3) detection of SSR molecular markers; (4) electrophoresis detection. The applications include: SSR amplification of letinous edodes strain, and comparison of the obtained band type with the fingerprint, which is consistent with the fingerprint, that is, letinous edodes L9015 strain. The present invention and conventional morphological detection, antagonistic test and fruiting test compared with short detection time, high accuracy and repeatability, the use of L9015 strain SSR fingerprint constructed by the invention, in the collection of 40 main cultivars in China over the years, letinous edodes has a specific.

【技术实现步骤摘要】
一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
本专利技术属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
技术介绍
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2015年的766万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。面对这种局势，就需要进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。本专利技术的一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由8对SSR标记组成。SSR标记是基于香菇全基因组测序后开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增引物，经过对不同香菇品种进行PCR扩增后获得的多态性标记。SSR标记具有扩增带型好，重复性高的特点。本专利技术对大量的SSR引物进行了筛选，获得了8对多态性高的引物，用这8对引物组合获得的图谱带型，检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。表1SSR标记详细信息列表本专利技术的一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；(8)加入100μL1×TE(Tris/EDTA)缓冲液，使沉淀溶解；(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL；PCR扩增得到的产物点样量为3μL。所述步骤(4)中的变性的具体工艺为：于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min。所述步骤(4)中的银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化，在高通量试验中较为高效实用。所述银染液的组成为1.5gAgNO3和1500mlH2O；显影液的组成为16gNaOH、1000mlH2O和8ml甲醛。本专利技术的一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的8对SSR引物，对扩增L9015菌株的总DNA进行PCR扩增，L9015菌种的扩增条带在收集的40份我国香菇主要栽培品种中具有专一性。表2为本专利技术使用的8对SSR引物在40份香菇品种中扩增出的所有等位片段的数量及编号(按照扩增片段从大到小编号，通过对照50bpladderDNAmarker确定各SSR引物扩增的各等位片段的相对分子量)。菌种L9015使用这8对SSR引物的扩增片段在总等位片段中的编号组合为：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)，表3为菌种L9015扩增片段组合的位置与大小。符合上述等位片段组合的菌种，即是香菇L9015菌种。表2SSR引物扩增的所有等位片段信息汇总表表3菌种L9015扩增的等位片段编号表有益效果本专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4d，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国40个香菇主栽菌种中具有L9015菌种的专一性，具有良好的应用前景。附图说明图1为香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱，其中M是50bpDNAladder，数字代表的是所用的8对SSR引物，箭头所指的是香菇L90本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148‑1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192‑1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌种的带型编号组合为：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)。...

【技术特征摘要】
1.一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌种的带型编号组合为：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)。2.一种如权利要求1所述的香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。3.根据权利要求2所述的一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：董慧，张美彦，章炉军，姜宁，于海龙，李玉，周峰，谭琦，尚晓冬，宋春艳，费如桂，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31