黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法及其应用。以待测黄牛全基因组DNA为模板，通过四引物扩增受阻突变体系PCR扩增长链非编码RNA ADNCR基因片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定长链非编码RNA ADNCR基因在g.1263T>A位点存在不同的基因型。结果发现，长链非编码RNA ADNCR基因g.1263T>A的单核苷酸不同类型与秦川牛的坐骨端宽性状之间存在显著相关，提示长链非编码RNA ADNCR基因单核苷酸多态不同类型可作为提高黄牛生长发育性状的DNA标记，有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体。

Single nucleotide polymorphism of ADNCR gene in cattle with four primer amplification, blocked mutation system, PCR detection method and its application

The invention discloses a four primer amplification blocked mutation system for cattle ADNCR gene single nucleotide polymorphism, a PCR detection method and an application thereof. With the test of cattle whole genome DNA as the template, through four primer amplification refractory mutation system PCR amplification of RNA encoding non chain ADNCR gene fragment, then agarose gel electrophoresis according to the electrophoresis results, identification of long chain non encoding RNA ADNCR gene in g.1263T> A locus had different genotypes. The results showed that long chain non RNA ADNCR encoding gene g.1263T> there is a significant correlation between A SNPs and different types of Qinchuan cattle hucklebone width characters, suggesting that long chain non encoding RNA single nucleotide polymorphism of ADNCR gene in different types of DNA can be used as a marker to improve the growth and development traits in cattle, conducive to the rapid establishment of excellent genetic traits in cattle population growth.

【技术实现步骤摘要】
黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法及其应用
本专利技术属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛长链非编码RNAADNCR基因T>A的单核苷酸多态性(SNP)的四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS-PCR)方法。
技术介绍
动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和关键。作为分子遗传标记的重要方式之一。单核苷酸多态性(SNP)指序列间单碱基替换或插入缺失，且在群体中的发生频率大于1％的多态类型(KwokandGu1999)。根据其在基因组中的位置可以划分为外显子多态性(包括错义突变、同义突变和无义突变)、基因间区多态性、内含子或3’-/5’-调控区多态性。SNP作为一种遗传标记，具有发生频率高、能稳定遗传、易进行自动化检测等优点，并且在不同物种、不同品种间SNP分布都存在差异，所以SNP可以作为评价群体遗传多样性的重要指标。目前，在遗传多样性研究中，杂合度是常用的一种变量，这种情况下，杂合度是指在基因组上检测到的所有SNP标记在不同样本间的差异程度(Purcelletal.2007)。发现并且充分利用个体间基因变异对家畜育种而言是非常重要的。近几年来，通过在家畜上已经定位出了很多与重要经济性状相关的位点。Fan等检测820个商品猪的全基因组SNP，并且对背膘厚、眼肌面积等性状进行分析，发现了与上述性状相关的候选基因，如MC4R、BMP2等(Fanetal.2011)。Jiang等通过对2093头中国荷斯坦奶牛的产奶性状进行研究，共检测出了105个与产奶性状显著相关的SNP标记位点(Jiangetal.2010)。此外，很多影响牛数量性状(包括体尺、繁殖力、产奶量、寿命、难产率等)的SNP位点及其候选基因逐渐被定位出来。SNP作为一种标记辅助选择(Marker-assistedselection)在家畜育种中具有重要的应用价值。迄今为止，检测SNPs的技术非常多，包括限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、单构链多态性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特异性PCR(AC-PCR)、直接测序法、新型高通量SNP检测技术和引入突变位点的PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在这些技术中，PCR-RFLP法是最早应用于分子人类学的SNP检测技术，因为该技术简单且易操作，对于检测单拷贝上(线粒体和Y染色体)的SNP，准确度非常高，但由于PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位点的限制，故在实际应用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技术简便、快速、灵敏，但最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序，且电泳条件要求较严格，故多用于DNA研究中的未知基因突变的检测和临床实验；直接测序法是最为准确的SNP检测方法，但其检测费用极其昂贵，且需要有测序仪等大型仪器，还需要非常熟练的技术人员和经验，故对于在一段很短的序列上存在多个SNP的检测是有优势的，但不适用于生产实际；新型高通量SNP检测技术，如SNP芯片、GWAS和第二代测序等对于样本量较小的实验研究，成本过高，在生产实际中应用较为局限；四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS-PCR)方法是一种新型的SNP检测方法，该方法只需要设计特定的引物，两个反应就能得到一个SNP位点的分型，能针对特定的基因位点，且四引物扩增受阻突变体系PCR不需要酶切，因此既减少了试验费用，又缩短了时间。总之，四引物扩增受阻突变体系PCR方法，不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求，因此，四引物扩增受阻突变体系PCR方法受到育种工作中的青睐，在动物分子育种的MAS体系中具有广阔应用前景。随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所以黄牛育种专家期望更早、更好、更快地获得黄牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现早期选择。LncRNA是一种长度在200-100000nt之间的RNA分子，不编码蛋白但却参与细胞内多种过程调控(Merceretal.,2009)，其种类、数量、功能都不明确。目前发现的许多lncRNA都具有保守的二级结构，一定的剪切形式以及亚细胞定位。它们在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以分为5种：正义链(sense)、反义链(antisense)、双向(bidirectional)、内含子间(intronic)、基因间(intergenic)(Kapranovetal.,2007；Coreetal.,2008；Guttmanetal.,2009；Merceretal.,2009；Orometal.,2010)，其所在的位置与其功能有一定的相关性。但人们对lncRNA的认识还处在初级阶段，lncRNA起初被认为是基因组转录的"噪音"，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能(Struhl,2007)。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。哺乳动物基因组序列中4％～9％的序列产生的转录本是lncRNA，相应的蛋白编码RNA的比例是1％(Pontingetal.,2009)，虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究将是RNA基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的"暗物质"。lncRNAs通常较长，具有mRNA样结构，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。lncRNAs启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog、CREB、Sp1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为四引物扩增受阻突变体系PCR引物，通过PCR扩增黄牛长链非编码RNA ADNCR基因片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定所述ADNCR基因单核苷酸多态位点的基因型；所述引物对P1为：上游内引物：5'‑ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT‑3'；下游内引物：5'‑CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT‑3'；上游外引物：5'‑GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC‑3'；下游外引物：5'‑GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为四引物扩增受阻突变体系PCR引物，通过PCR扩增黄牛长链非编码RNAADNCR基因片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定所述ADNCR基因单核苷酸多态位点的基因型；所述引物对P1为：上游内引物：5'-ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT-3'；下游内引物：5'-CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT-3'；上游外引物：5'-GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC-3'；下游外引物：5'-GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC-3'。2.根据权利要求1所述一种黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法，其特征在于：所述单核苷酸多态性为长链非编码RNAADNCR基因g.1263T>A突变。3.根据权利要求1所述一种黄牛ADNCR基因单核苷酸多态性的四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝贤勇，金云云，张思欢，杨青，陈宏，雷初朝，黄永震，党瑞华，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61