一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法技术

本发明专利技术公开了一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法，它是在大鳞副泥鳅TYR基因序列上设计TYR基因靶位点，然后设计上游引物及与其匹配的下游引物，以骨架质粒为模版进行PCR扩增，体外转录、纯化后得到gRNA；以线性化Cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到Cas9mRNA；对大鳞副泥鳅受精卵显微注射，之后将受精卵进行孵化培育，并对基因敲除鱼进行杂交，获得能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。

Method for breeding albino large scaly loach with stable inheritance

The invention discloses a stable genetic albino loach breeding method, it is the design of TYR gene loci in Misgurnus TYR gene sequence, and then design the upstream primer and the corresponding primers, using plasmid as the template for PCR amplification, transcription in vitro, purified by gRNA; the linearized Cas9 plasmid as template, transcription in vitro, purified by Cas9mRNA; on loach embryo microinjection, the fertilized egg hatching, and the knockout fish were obtained stably inherited white of loach.

【技术实现步骤摘要】
一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法
本专利技术属于分子育种领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9系统敲除大鳞副泥鳅色素基因从而生产白化大鳞副泥鳅的方法。
技术介绍
随着观赏水族行业在国内的稳步发展，观赏类生物的品种的逐年激增，以鳅科鱼类为代表的原生鱼种也逐渐为广大水族爱好者所熟知。其中，白化鳅科鱼种从外观上可以看到其皮肤白色或浅红色，眼睛红色并且透明。因为这种性状的奇异性和稀少性，所以尤其受到广大水族消费者的追捧。目前，这些新的观赏鱼类资源主要由野外捕捞筛选，随机性大，产量极少，难已满足广大水族爱好者的猎奇需求。并且由于白化鱼种的白化鱼苗发育胚胎的透明性，它们经常被用来做单性发育的研究材料，为研究遗传基因在正常鱼体所发挥的作用提供可见的有力的证据。因此，运用现代生物技术定向改造鱼类体色，稳定批量生产符合市场及科研需求的白化鳅科鱼类将具有很大的发展空间。CRISPR/Cas9基因敲除系统是近两年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工的改造，目前已被广泛运用于多种模式生物的研究，成为一种强大的研究工具。酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是催化黑色素形成的关键酶，主要存在于黑色素细胞中。黑色素细胞广泛存在于鱼类等脊椎动物的表皮中。TYR基因主要在皮肤、脑和眼中都有表达，其中眼部和黑色皮肤表达最高。从青鳉鱼中分离出多个白化突变体，对它们TYR突变基因的分析表明，缺失突变和转座子插入是导致白化的两种主要突变类型。将正常的TYR基因转移到白化鱼体内，转基因鱼的体色得到了不同程度的恢复。是一种常染色体隐性遗传病。因此，在分子育种领域中，利用CRISPR/Cas9系统敲除鳅科鱼类TYR基因生产白化鳅科鱼种的技术，将是一种具有重大意义的专利技术，且目前还没有出现相关研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统敲除鳅科鱼类大鳞副泥鳅的TYR基因，从而生产白化大鳞副泥鳅的分子育种技术。用于定向改造鱼类体色，不仅可以有效解决观赏鱼市场白化鱼种供需困难的问题，还可以提供科学研究所需要的白化鱼类胚胎。本专利技术通过以下内容实现：1、大鳞副泥鳅TYR基因序列信息的确定：①首先，使用RNAisoPlus试剂(TaKaRa，日本)提取大鳞副泥鳅皮肤总RNA，再使用逆转录试剂盒1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa，日本)体外合成第一链cDNA。②由NCBI数据库中获取斑马鱼，草鱼，团头鲂等鱼类TYR基因全长cDNA序列，后进行多重比对，读取这些鱼类保守区域氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物，用于克隆大鳞副泥鳅TYR基因核心片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。③使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech,USA)试剂盒，参照试剂盒推荐方法合成5’、3’-RACEcDNA第一链。再在②步骤中得到的核心片段序列上的设计RACE引物，分别以5’、3’-RACEcDNA第一链为模板，克隆大鳞副泥鳅TYR基因5’和3’末端片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。④拼接得到大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息。大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息如SEQIDNO：1所示。2、CRISPR/Cas9靶位点设计及确认：在大鳞副泥鳅TYR基因的ORF序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，设计TYR基因靶位点。靶位点通式为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’(N为任意碱基)，尽量在ORF前端设计。同时在靶位点周围300-500bp大小范围内设计引物进行PCR扩增，扩增产物直接送测序。要求：①正反向引物距离靶位点处至少100bp。②PCR条带清晰，无杂带。③测序结果与设计的靶位点序列相同，且测序峰图显示为纯合子(即未出现叠峰)。大鳞副泥鳅TYR基因靶位点序列信息如SEQIDNO：2所示。3、Cas9mRNA和gRNA的制备：以纯化后的线性化Cas9质粒(pSP6-2sNLS-SpCas9vector)为模版，进行体外转录得到Cas9mRNA，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为830ng/μL。设计含有TYR基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以gRNA骨架质粒为模版进行PCR扩增，再以纯化后的产物为模版，进行体外转录得到gRNA，将其纯化后于-80℃保存，保存浓度为1210ng/μL。含有TYR基因靶位点序列的上游引物如SEQIDNO：3所示，与其匹配的下游引物如SEQIDNO：4所示。4、体外显微注射：注射前一天晚上，挑选2对发育较好的大鳞副泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每kg雌亲鱼注射LRH-A240ug、DOM4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为27℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，每次注射的量为2nL，注射部位为动物极。5、TYR基因敲除鱼的筛选：在步骤4中得到的受精卵孵化48小时之后，对比相同孵化条件下的野生型大鳞副泥鳅胚胎，在显微镜下挑选出体色素出现异常的基因敲除鱼。6、能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅的获得：将步骤5中得到的TYR基因敲除鱼进行杂交，获得的F1代中无体色素出现的个体，即为能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。本专利技术具有以下优点：1、TYR基因敲除鱼的筛选本专利技术敲除效率极高，且无需通过分子手段筛选，只需通过肉眼观察，即可以高效获得大量TYR基因敲除成功个体。2、能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅的获得将TYR基因敲除鱼作为亲本杂交，F1代即可得到能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅，仍无需通过分子手段，只需肉眼观察筛选。简单高效，周期短。附图说明图1是T7E1酶切检测突变体的琼脂糖凝胶电泳图。图2是TYR基因敲除大鳞副泥鳅的杂交策略示意图。图3是野生、G0代、F1代白化大鳞副泥鳅的对比照片。具体实施方式下面结合实施案例对本专利技术实施应用进行说明。1、大鳞副泥鳅皮肤总RNA的提取使用TaKaRa公司RNAisoPlus试剂进行大鳞副泥鳅总RNA的提取，具体步骤如下：1)提取RNA：所用器皿、手术剪、镊子均要用DEPC处理过夜；所用到的水为TaKaRa公司购买的RNase-freeWater；离心EP管，各型号枪头为提RNA专用的或者用DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理。注意：提取总RNA过程中要及时佩戴口罩，更换手套，避免说话。实验前将取样器械置于冰上预冷；2)处死大鳞副泥鳅，快速分离皮肤组织，并取30mg-50mg组织样品于2mL离心管中，离心管置于冰浴，事先加入1.5mLRNAisoPlus试剂，3颗经DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理的玻璃珠。加好后使用组织破碎仪破碎至呈无颗粒透明状即可；3)取出离心管，室温静置5min；4)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心5min；5)离心后取出，吸取上清液转移到新的1.5mL离心管中；6)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，用量为RNAisoPlus试剂体积的1/5，盖上离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法，其特征在于包括以下步骤：1)在大鳞副泥鳅TYR基因序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，设计TYR基因靶位点，所述大鳞副泥鳅TYR基因序列如SEQ ID NO：1所示；2)设计含有TYR基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以骨架质粒为模版进行PCR扩增，体外转录、纯化后得到gRNA；3)以线性化Cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到Cas9mRNA；4)对大鳞副泥鳅受精卵显微注射gRNA和Cas9mRNA，注射部位为动物极，之后将受精卵进行孵化培育；5)受精卵孵化后，挑选体色素出现异常的基因敲除鱼，进行杂交，获得的F1代中无体色素出现的个体，即为能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。

【技术特征摘要】
1.一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法，其特征在于包括以下步骤：1)在大鳞副泥鳅TYR基因序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，设计TYR基因靶位点，所述大鳞副泥鳅TYR基因序列如SEQIDNO：1所示；2)设计含有TYR基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以骨架质粒为模版进行PCR扩增，体外转录、纯化后得到gRNA；3)以线性化Cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到Cas9mRNA；4)对大鳞副泥鳅受精卵显微注射gRNA和Cas9mRNA，注射部位为动物极，之后将受精卵进行孵化培育；5)受精卵孵化后，挑选体色素出现异常的基因敲除鱼，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹小娟，徐秀文，高坚，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42