一种造纸用甾醇脂酶的基因、表达载体、菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种造纸用甾醇脂酶的基因、表达载体、菌株及其应用，属于生物工程领域。该基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的甾醇脂酶基因利用密码子优化、大肠杆菌表达、毕赤酵母表达等技术实现在毕赤酵母中的高表达；得到的甾醇脂酶酶活为0.4U/mL左右。表达的甾醇脂酶具有耐高温、耐弱碱性质；本发明专利技术所述的甾醇脂酶可应用于废纸脱墨，通过水解废纸表面和纸张之间的胶黏物来去除油墨粒子，可以保证再生纸质量的稳定与纸机的运行效率。

Sterol lipase gene for paper making, expression vector, strain and application thereof

The invention discloses a sterol lipase gene for papermaking, an expression vector, a strain and an application thereof, belonging to the field of biological engineering. The nucleotide sequence of the gene encoding is shown as SEQ ID NO:1. The sterol lipase gene provided by the invention achieves high expression in Pichia pastoris by means of codon optimization, Escherichia coli expression and Pichia pastoris expression, and the lipase activity of the sterol lipase obtained is about 0.4U/mL. The expression of sterol lipase with high temperature, alkali resistant properties; sterol lipase provided by the invention can be used in Deinking stickies, through hydrolysis of waste paper and paper between the surface to remove the ink particles, can guarantee the stable operation efficiency of recycled paper quality and paper machine.

【技术实现步骤摘要】
一种造纸用甾醇脂酶的基因、表达载体、菌株及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因、表达载体、菌株及其应用。
技术介绍
造纸工业是支撑我国国民经济的重要产业之一，但是资源匮乏、能源短缺和污染严重等问题正制约造纸工业的发展，扩大废纸利用正是解决这些问题的有效途径。但是废纸因其成分复杂，含有大量的细小组分和阴离子杂质，在这些杂质中尤其是胶黏物很难除去，一方面胶黏物的存在会增加纸张上的孔洞、尘埃点，降低纸张质量；另一方面，其在成形网、压榨部以及干燥部沉积易引起断纸，导致滤水性能变差，纸机的车速减低，因而胶黏物的处理也是废纸制浆中的重大课题。在废纸制浆中，胶黏物的来源比较复杂，主要有以下几个来源：(1)天然树脂。在废纸浆中主要是一些残余脱墨剂；(2)热融物。一部分来源于用于封装纸箱、纸袋和书本杂质的胶黏剂，另一部分来源于某些具有特殊用途纸品中的防水、防油剂，如蜡和蜡质化合物；(3)压敏胶黏剂。来源于各种包装用标签和自封袋；(4)涂布粘合剂。来源于加工纸生产过程中所使用的各种涂布黏合剂；(5)施胶剂。来源于各种施胶纸；(6)油墨联接料和残余油墨；(7)无机填料和细小纤维。目前，去除和控制浆料中胶黏物的方法主要有机械法和化学法。筛选、净化、洗涤、热分散和浮选等物理机械法能去除大部分原生胶黏物。而化学法主要是通过化学吸附、改性、分散、固定、表面钝化等作用来达到控制胶黏物的目的。随着生物技术的发展，具有高效性、专一性、对环境无污染性等优点的生物酶在制浆造纸领域中得到了越来越广泛的应用。生物酶控制纸浆中胶黏物也成为一个新的研究方向。大多数胶黏物都含有大量能将胶黏物的基本结构组分连接在一起的酯键，酯类酶能催化酯键断裂，把胶黏物分解成较小的基本组分。而且酯键一旦断裂，胶黏物的基本组分就很难在系统中重新聚合。巴克曼实验室化工(上海)有限公司创造了用于解决二次纤维中胶黏物问题的最新技术—生物酶Optimyze。该酯类酶制剂能使胶黏物中的酯键断裂，不仅将大胶黏物分解为微小胶黏物，而且使胶黏物的基本组分失去或降低黏性，使微小胶黏物很难在系统中重新聚合，从根本上解决了利用二次纤维的造纸过程由于胶黏物而引起的一系列问题。采用生物酶法是近年来处理废纸浆胶黏物研究的热点。油墨中一般含有天然或合成的树脂成分，使颜料和纸页结合。因此可以利用酯类酶来部分水解油墨中所含有的树脂或粘结剂，碎解油墨，使其与纤维分离。处理过程中主要是以分解油墨与纤维表面的连接料的方式释放出油墨粒子，对纤维强度和纸浆得率的影响较小，同时对去除废纸浆中其他黏性物质也有一定的效果。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因。该基因能够编码耐高温、耐碱、高效稳定的甾醇脂酶。本专利技术的另一目的在于提供一种表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种生产菌株。本专利技术的另一目的在于提供一种重组甾醇脂酶。本专利技术的再一目的在于提供上述重组甾醇脂酶的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因，所述的甾醇脂酶CHE的核苷酸编码序列如SEQIDNO：1所示。M.Nishimura等在1994年首次克隆了淡紫链霉菌(StreptomyceslavendulaeH646-SY2)的甾醇脂酶(CHE)基因，HongyuXiang等在2006年将其在大肠杆菌中成功表达并研究了其主要的酶学性质，发现该甾醇脂酶具有耐热性、耐弱碱性，可能具有应用于造纸工业的理想特性。但此后并没有看到关于该酶应用于生产的报道。其原因可能在于，其一，在原始菌株的表达量低；其二，尽管GashawMamo等将其基因在大肠杆菌中表达，但表达的酶活相对较低，分泌的酶活不足0.05U/mL，该酶不能完全分泌，有部分分布在在胞内及周质空间而且表达量不高，因而限制了其作为造纸工业用酶制剂的进一步开发。本专利技术采用密码子优化、基因全合成等方法，实现对CHE(淡紫链霉菌的甾醇脂酶)基因的分子改造和人工组建，得到一种能够高效表达甾醇脂酶的基因。专利技术人根据美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的CHE基因序列，对序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子，再将优化后的基因序列用DNAWORKS软件(http://mcl1.ncifcrf.gov/lukowski.html)，设计全基因合成的引物，设计了2条引物来合成CHE基因序列，得到的甾醇脂酶基因的核苷酸编码序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术提供一种携带上述CHE基因的表达载体；所述的表达载体是适用于毕赤酵母中表达的载体。所述的表达载体是将上述CHE基因插入至pPICZαA中。所述的表达载体是将上述CHE基因插入至pPICZαA中EcoRI和NotI酶切位点之间；命名为pPICZαA-CHE。通过在商用毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA中连入CHE基因，构成重组质粒pPICZαA-CHE。表达载体pPICZαA-CHE可以通过以下技术措施实现：采用第一个专利技术目的所述方法全基因合成CHE时，在上游和下游已分别引入了限制性内切酶EcoRI和NotI酶切位点。因此将全基因PCR产物和毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA质粒(invitrogen)都用EcoRI和NotI双酶切，体外连接构建重组质粒pPICZαA-CHE，得到重组表达载体pPICZαA-CHE。本专利技术又提供一种含有上述CHE基因的毕赤酵母菌株；所述的毕赤酵母菌株含有上述表达载体之一所述的表达载体。毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类酵母菌，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源。作为真核表达系统，具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；酵母生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价；外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，外源基因不会发生随生长繁殖而丢失；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上；同时，毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于纯化。毕赤酵母基因工程菌株PichiaPastorisX33/pPICZαA-CHE可以通过以下技术措施实现：以LiCl法将SacI线性化的重组质粒pPICZαA-CHE转化毕赤巴斯德酵母宿主菌PichiaPastorisX33，转化物涂布于MD平板，培养2～3天。将MD平板上的转化子分别接种于含不同浓度的Zeocin(博莱霉素)抗性YPD平板上，培养3～5天。将高浓度Zeocin-YPD平板上出现的转化子挑取其对应的单克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，进行酵母基因组PCR鉴定，获得重组转化子。在超净工作台内挑取经重组毕赤酵母菌落PCR鉴定为阳性的转化子接种至25mLBMGY液体培养基中(250mL锥形瓶装液量为25mL)，30℃、250rpm振荡培养至OD600＝2～6，同时接种重组毕赤酵母X33/pPICZαA作为阴性对照；收集部分培养液在室温8000rpm离心2min；转移菌体至25mLBMMY培养基中(250mL锥形瓶装液量为25mL)，控制起始OD600＝1，30℃、250rpm震荡培养，每24h取样分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因，其特征在于：所述的甾醇脂酶的基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因，其特征在于：所述的甾醇脂酶的基因的核苷酸编码序列如SEQIDNO：1所示。2.一种含有权利要求1所述的能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因的表达载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是适用于毕赤酵母中表达的载体。4.根据权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是将权利要求1所述的能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因插入至pPICZαA中。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是将权利要求1所述的能够高效表达造纸用甾醇脂酶的基因插入至pPICZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩双艳，高士鹏，李玲，林影，郑穗平，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44