金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203及其筛选方法和应用，所述核酸适配体C203的序列为：AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGCACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC；它的筛选方法为：基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体；本发明专利技术的核酸适配体C203能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合。

Nucleic acid aptamer C203 of Staphylococcus aureus enterotoxin C2 and screening method and application thereof

The invention relates to a nucleic acid of staphylococcal enterotoxin C2 aptamer C203 and screening method and application thereof, wherein the sequence of aptamers for C203: AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGCACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC; screening methods for it: aptamers in vitro screening technology based on SELEX, using carboxyl magnetic beads as solid medium, with staphylococcal enterotoxin C2 as the target, through the staphylococcal enterotoxin C2 beads from the ssDNA library screened nuclear acid binding with staphylococcal enterotoxin C2 specific aptamer; the nucleic acid aptamer C203 high affinity and high specificity with staphylococcal enterotoxin C2 binding.

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203及其筛选方法和应用
本专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203及其筛选方法和应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的外毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素可不经抗原提呈细胞加工，直接与MHCⅡ类分子非限制性的结合，形成的复合物与T淋巴细胞抗原受体的β链V区结合，大量激活T淋巴细胞，使其活化、增殖，并释放大量的炎性细胞因子引起强烈的免疫应答，最终导致炎症失控和多器官的损害，引起毒素休克等疾病。此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素较能抗消化，耐热以及只需很小剂量就可引发T细胞应答，金黄色葡萄球菌肠毒素也被作为肿瘤治疗的超抗原药物。金黄色葡萄球菌肠毒素有多个血清型，分别是A型、B型、C1型、C2型、C3型、D型、E型、G型、H型、I型、M型、N型、O型和毒性休克综合症1型毒素、毒性休克综合症2型毒素等，其中金黄色葡萄球菌肠毒素C2不仅与金黄色葡萄球菌相关感染有关，同时也是金黄色葡萄球菌肠毒素中应用最多的超抗原药物。检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2主要采用免疫学方法，包括沉淀反应、凝集反应、ELISA、固相RIA、生物传感器等，这些方法使用抗体作为金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测的识别元件，而抗体的制备存在周期长，步骤繁琐，成本高等不足之处。近年来，以检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因为目标的分子生物学方法发展较快，但PCR等分子生物学方法仍存在假阳性、假阴性等技术难题。因此，研制具有更高灵敏度、经济、简便的金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测新技术，对于食品卫生监督、临床金黄色葡萄球菌感染的诊疗等都有重要意义。治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起的毒素休克，临床常采用抗炎、补液等对症支持疗法。最新研究发现，抑制金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性，在初始阶段阻断炎症级联反应的发生，是治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的有效策略。基于此策略，研制各种多肽药物、抗体药物、疫苗等，已成为的金黄色葡萄球菌肠毒素C2生物技术新药研究的热点。金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原药物的获得，常采用基因克隆的方法，将金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因片段克隆至原核表达载体中，在大肠杆菌中表达并纯化。但这种方法中纯化步骤常采用离子交换方法或带标签的亲和纯化方法，前者吸附选择特异性差，后者试剂成本较高。适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适配体的获得通过指数富集配体的系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)的体外筛选过程。核酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性、经济等特点。基于上述优势开发的核酸适配体药物可特异性阻断靶标功能；将核酸适配体作为识别元件，还可开发简便、精准的检测新技术以及高效、经济的亲和纯化系统。因此，筛选出高特异性、高亲和力结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体具有重要的科研、临床和市场价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203及其筛选方法和应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，它的序列如下：AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGC40ACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC71所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的应用，在分离、纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的应用。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的应用，在分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的非疾病诊断和治疗方法应用。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的应用，在金黄色葡萄球菌肠毒素C2为效应分子的靶向治疗中的应用。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的应用，在治疗金黄色葡萄球菌感染中以及在治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起相关综合症中的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：1.该核酸适配体C203无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。2.该核酸适配体C203的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。3.该核酸适配体C203能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合，解离常数为3.05±0.89nM，且它对其他同源蛋白不具有识别功能。4.该核酸适配体C203在金黄色葡萄球菌肠毒素C2的分离、纯化，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关的食品安全检测，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌感染的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌肠毒素C2介导的靶向治疗等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。附图说明图1为核酸适配体C203二级结构的生物学信息学模拟图。图2为荧光结合率实验分析核酸适配体C203的特异性图。在图2中，横坐标为分析的蛋白，纵坐标为荧光结合率。图3为荧光结合率实验分析核酸适配体C203结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的解离常数绘制曲线。解离常数(Kd)为3.05±0.89nM。在图3中，横坐标为DNA浓度(pM)，纵坐标为荧光结合率。图4为CCK-8法测定核酸适配体C203对金黄色葡萄球菌肠毒素C2诱导的PBMC增殖活性的作用。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，它的序列如下：AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGC40ACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC71所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，在25℃，100mMNa+，1mMMg2+的条件下，其空间结构如下：所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，对所述核酸适配体C203的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，对所述核酸适配体C203做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的筛选方法，它包括以下步骤：(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，其特征在于：它的序列如下：AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGC 40ACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC          71

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，其特征在于：它的序列如下：AGGGCCGAGCTCACTTGTCAGGTCGCCTCTTGCGCGGCGC40ACGGGCGGAAACGCCGCCGGCACAATTGTGC712.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，其特征在于：在25℃，100mMNa+，1mMMg2+的条件下，其空间结构如下：3.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，其特征在于：对所述核酸适配体C203的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。4.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203，其特征在于：对所述核酸适配体C203做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。5.根据权利要求1-4任意一项所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C203的筛选方法，其特征在于：它包括以下步骤：(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’；(2)将金黄色葡萄球菌肠毒素C2与羧基磁珠偶联制备金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠；(3)将ssDNA文库进行热激活处理；(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王开宇，兰小鹏，廖剑，洪笑迁，闫慧慧，杨湘越，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区福州总医院，
类型：发明
国别省市：福建,35