具耐热性的果胶酶制造技术

本申请涉及一种具耐热性的果胶酶，其氨基酸序列为将序列编号2第181位置的丝氨酸(serine)用一氨基酸取代修饰的序列，其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)。

Pectinase with heat resistance

The invention relates to a thermostable pectinase, the amino acid sequence of the sequence number 2 position 181st serine (serine) substituted with a modified amino acid sequence, the amino acid phenylalanine from which is used to replace the (phenylalanine), methionine (methionine) and leucine (leucine).

【技术实现步骤摘要】
具耐热性的果胶酶
本申请涉及一种果胶酶，尤指一种具耐热性的果胶酶。
技术介绍
果胶(Pectin)是植物细胞壁中主要的组成之一，绝大部分存在于初生细胞壁(primarycellwall)以及中胶层(middlelamella)。果胶物质是种复杂的异质多醣，主要是以D-半乳糖醛酸(D-galacturonicacid)，经由α-1,4-糖苷键结组成其骨干。而此骨干可被进一步地修饰，像是甲基酯化(methyl-esterification)或取代成乙酰基(acetylgroups)。果胶大致上可被分成三大类：同质半乳醛酸聚醣(homogalacturonan)、木糖半乳醛酸聚醣(xylogalacturonan)以及鼠李半乳醛酸聚醣(rhamnogalacturonan)。第三种果胶的结构最为复杂，其由重复的鼠李糖-半乳糖醛酸组成其主链，且有不同种的糖，像是半乳糖、木糖以及阿拉伯糖(arabinose)形成其支链。由于这样复杂构成的果胶，其完整的分解需要依靠好几种不同的果胶酶(pectinases)来共同作用。果胶酶在自然界中广泛地存在于许多不同的细菌、酵母、真菌以及植物中，大致上可分为三大种：果胶水解酶(hydrolases)、果胶裂解酶(lyases)以及果胶酯酶(esterases)。在这些果胶酶中，果胶裂解酶(pectatelyase；endopolygalacturonatelyase；EC4.2.2.2)是分解果胶过程中的关键酶种之一。它可以透过反式消除机制(transeliminationmechanism)任意地催化半乳醛酸聚糖中的α-1,4-糖苷键结，进而生成不饱和半乳醛酸寡糖的产物。长久以来，果胶酶已经被广泛应用在食品以及制酒工业上。近年来，更延伸应用在许多不同的工业上，像是造纸、纺织以及饲料中。因为果胶酶在工业上具有极高的经济应用价值，许多研究不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的蛋白，都企图想要找到更适合于工业应用的果胶酶。在许多提升工业酶的策略中，根据蛋白结构分析，进而逻辑性地设计突变点是改造蛋白的主要方法之一。而一个好的工业酶所要具备的理想条件之一就是高耐热性，因为高耐热性的酶通常具有较高的蛋白稳定性以及较佳性能的酶作用力，故也较有利于工业应用。因此，本申请利用逻辑性的突变设计去增加果胶裂解酶的耐热性，进而提升它在工业上的应用价值。
技术实现思路
本申请的目的在于改造现有果胶裂解酶，利用结构分析及点突变技术，有效提升果胶裂解酶的耐热性，藉以增加果胶裂解酶的工业应用价值。为达上述目的，本申请的广义实施方式提供一种果胶酶，其氨基酸序列为将序列编号2第181位置的丝氨酸(serine)以一氨基酸取代修饰的序列，其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)。编码该序列编号2的基因是从坎皮纳斯类芽孢杆菌(PaenibacilluscampinasensisBL-11)所分离出来的PcPEL基因。该果胶酶是果胶裂解酶。在一个实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号4的氨基酸序列。在个一实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号6的氨基酸序列。在个一实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号8的氨基酸序列。又，该果胶酶的用途为用于制造食品、制酒、造纸、纺织或制造饲料。附图说明图1显示PcPEL的核苷酸序列以及氨基酸序列。图2显示PcPEL的蛋白结构。图3显示突变引物序列。图4显示S181F的核苷酸序列以及氨基酸序列。图5显示S181M的核苷酸序列以及氨基酸序列。图6显示S181L的核苷酸序列以及氨基酸序列。图7显示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三种突变蛋白的耐热性分析。具体实施方式体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的态样上具有各种的变化，其均不脱离本申请的范围，且其中的说明及图示在本质上用作说明之用，而非用以限制本申请。本申请的果胶裂解酶(PcPEL)是从嗜碱性细菌坎皮纳斯类芽孢杆菌(PaenibacilluscampinasensisBL-11)菌株中所分离出来的基因。根据先前文献中指出，该果胶裂解酶的最适活性是在50℃以及pH10的条件之下。为了提升此果胶裂解酶的耐热性，本申请欲通过结构分析以及点突变技术(site-directedmutagenesis)对其进行改造。因此，本申请利用X-ray结晶学技术去解开PcPEL的蛋白三级结构，进而阐明其详细的结构信息。为了提升PcPEL的耐热性，本申请根据其结构分析挑选位于活性区附近的第181个氨基酸的丝氨酸(serine)，利用点突变技术，分别单一突变成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，因而成功地提高其耐热性，也进一步地增加此果胶裂解酶的工业应用价值。以下将详述本申请改造果胶裂解酶的方法及其所得到的改良果胶裂解酶蛋白。首先，PcPEL基因被构建在pPICZαA的载体上，其中如图1所示，PcPEL基因包含858个碱基(不含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)以及286个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。线性化之后的质粒DNA接着被转化到毕赤酵母(Pichiapastoris)中，再利用含有0.1mg/mlzeocin抗生素的YPD平板，在30℃中培养2天，筛选出成功转化的细胞。接着挑选菌落，分别接种到YPD培养基中增生，再进一步地将菌分离出来，转移到含有0.5％甲醇的BMMY培养基内，进而诱导其目标蛋白的表达。经由离心步骤，收集含有表达出的目标蛋白的上清液。为了后续的蛋白纯化步骤，本申请利用含有25mMTris；pH7.5的缓冲液进行两次透析。再利用FPLC系统以及DEAE纯化管柱，纯化出PcPEL蛋白。最后，为了后续的结晶实验，纯化的蛋白再浓缩至10mg/ml的浓度。为了利用X-ray结晶学技术解析蛋白结构，必须先得到蛋白晶体。本申请利用座滴式蒸气扩散法以及结晶试剂盒筛选出成功结晶的条件，再进行调整之后，得到适当的结晶条件是在0.1MBis-Tris；pH6.5、0.2MLithiumsulfate以及25％PEG3350的环境中，在室温下培养2天。而相位角问题则是通过分子置换法(molecularreplacement)解开，经由计算机运算之后，得到PcPEL的蛋白结构。如图2所示，PcPEL的蛋白结构属于典型PL10家族的(α/α)3barrel蛋白折叠。本申请欲利用增加PcPEL蛋白的疏水性作用力(hydrophobicinteraction)，来进一步提升其耐热性。通过结构分析，本申请挑选位于活性区附近第181位置的丝氨酸(serine)分别突变成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，亦即，本申请利用点突变技术获得PcPEL的三种突变基因，分别是S181F、S181M以及S181L。突变方式为利用PCR分别取得三种突变基因，而当中所用到的突变引物列在图3。原始的模板DNA则利用限制酶DpnI移除掉。突变基因个别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种果胶酶，其氨基酸序列为将序列编号2第181位置的丝氨酸用一氨基酸取代修饰的序列，其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸、甲硫氨酸以及亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种果胶酶，其氨基酸序列为将序列编号2第181位置的丝氨酸用一氨基酸取代修饰的序列，其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸、甲硫氨酸以及亮氨酸。2.如权利要求1所述的果胶酶，其中编码该序列编号2的基因是从坎皮纳斯类芽孢杆菌(PaenibacilluscampinasensisBL-11)所分离出来的PcPEL基因。3.如权利要求1所述的果胶酶，其中该果胶酶是果胶裂解酶。4.如权利要求1所述的果胶酶，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞庭，郑雅珊，黄建文，吴姿慧，赖惠琳，林正言，柯宗佑，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44