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短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用制造技术

技术编号:15320942 阅读:153 留言:0更新日期:2017-05-16 03:47
本发明专利技术提供一种短链脱氢酶的突变体,重组表达载体和基因工程菌及其突变体的制备方法,以及上述突变体或产生突变体的基因工程菌在不对称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。所述短链脱氢酶突变体或含有突变体基因工程菌不对称还原制备手性醇具有高催化活性,能够合成高光学纯度手性醇(ee>99%)。

Mutant of short chain dehydrogenase, recombinant expression vector, gene engineering bacteria and Application

The present invention provides a short chain dehydrogenase mutant recombinant expression vector and preparation method of gene engineering strain and its mutants, and the mutant gene engineering bacteria or mutants in a series of asymmetric reduction of prochiral ketones were prepared using optically pure chiral alcohols. The short chain dehydrogenase mutant or the mutant gene engineering bacterium is asymmetrically reduced to prepare chiral alcohols, which has high catalytic activity and can synthesize highly optically pure chiral alcohols (ee> 99%).

【技术实现步骤摘要】
短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用
本专利技术属于酶工程
,具体涉及一种短链脱氢酶的分子改造,同时涉及相应突变酶基因的重组表达载体和重组表达转化体,以及上述突变体酶或含有突变体酶的重组细胞在不对称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。
技术介绍
手性醇是一类在手性碳上连有羟基的旋光性化合物。羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团的性质使手性醇成为最重要的手性砌块之一。具有光学活性的手性醇被广泛用于合成手性药物、精细化学品和农用化学品等。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法,理论上能将底物酮100%转化为单一对映体的手性醇,具有很高的工业应用价值。其中,生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。在具有催化不对称还原潜手性酮活性的酶中,短链脱氢酶由于其催化底物谱广、热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而倍受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。然而,大多数生物催化剂催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则,遵循anti-Prelog规则催化潜手性酮还原的生物催化剂相对较少。这将限制作为手性药物合成重要中间体anti-Prelog手性醇的制备及生物催化绿色合成技术的推广。本课题组前期筛选得到一株能够以anti-Prelog立体选择性催化潜手性酮还原的菌株短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCCNO:M2014520(专利公开号CN105316250A);并从其基因组中挖掘并克隆表达了遵循anti-Prelog规则高立体选择性还原潜手性酮的短链脱氢酶EbSDR8(专利公开号CN105238768A)。但是,该短链脱氢酶的催化活性远不能满足工业化生产要求,因此,有必要通过相关技术提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供酶活提高的短链脱氢酶EbSDR8的突变体及其重组工程菌等,为手性醇的合成提供强有力的生物催化剂。为了实现上述目的,本专利技术采用以下技术方案:本专利技术的第一方面提供催化活性显著提高的短链脱氢酶EbSDR8的突变体,这些突变体是在SEQIDNo.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上进行构建,该短链脱氢酶核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示(专利公开号CN105238768A)。所述突变体为在SEQIDNo.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变或多点组合突变:94位甘氨酸(Gly94)、145位组氨酸(His145)、153位丝氨酸(Ser153)、188位酪氨酸(Tyr188)和193位亮氨酸(Leu193)。优选地,所述突变体是分别在短链脱氢酶EbSDR8的Gly94和Ser153两个位点上进行取代,且更优选的,上述两个优选位点同时进行取代时具有更优的催化活性。优选地,所述短链脱氢酶EbSDR8的突变体分别为:将94位甘氨酸突变为丙氨酸(Gly94Ala,即G94A),其是由SEQIDNo.4所示的氨基酸序列组成;将153位丝氨酸突变为亮氨酸(Ser153Leu,即S153L),其是由SEQIDNo.6所示的氨基酸序列组成;且上述两个优选单点突变体的组合突变(Gly94Ala/Ser153Leu,即G94A/S153L)具有更优的催化活性,其是由SEQIDNo.8所示的氨基酸序列组成。任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有短链脱氢酶活性的,仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第二方面提供上述短链脱氢酶突变体的核苷酸序列。其中突变体G94A核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示,其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示;突变体S153L核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示,其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.6所示;突变体G94A/S153L核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示,其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.8所示。如本领域技术人员所知,本专利技术的短链脱氢酶突变体的核苷酸序列也可以是编码序列表中所示氨基酸组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对所示突变体核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列,只要其与核苷酸具有90%以上的同源性,均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第三方面提供一种包含本专利技术的短链脱氢酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的短链脱氢酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体,如各种质粒、噬菌体或病毒载体等,优选pET-30a。本专利技术的第四方面提供一种表达重组短链脱氢酶突变体的基因工程菌,可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物,只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的短链脱氢酶突变体基因可以有效表达。本专利技术优选大肠杆菌,更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第五方面提供一种重组短链脱氢酶突变体的制备方法,包括如下步骤:培养本专利技术的重组表达转化体,诱导获得重组短链脱氢酶突变体蛋白。其中,所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本专利技术的短链脱氢酶突变体蛋白的培养基,优选LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L,pH7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制,只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶突变体蛋白即可。优选下述方法:将本专利技术涉及的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养,当培养液的光密度OD600达到0.5~0.7时,在终浓度为0.1~1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下,即可高效表达本专利技术的重组短链脱氢酶突变体蛋白。本专利技术的第六方面提供所述短链脱氢酶突变体或其基因工程菌在不对称催化潜手性酮制备光学活性手性醇中的应用。具体的,所述的应用为:以潜手性酮(I)为底物,所述短链脱氢酶突变体或其重组细胞,以NADH或NADPH为辅酶,20~50℃下,于pH5.5~10.5的缓冲液构成的转化反应体系a中反应,反应完全后,将反应液分离纯化得到相应产物。其中,R1和R2为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。具体的R1和R2可以为-H,-CH3,-CH2CH3,-CH2CH2CH3,-CH2X,-CX3,-X,-OCH3,-OCH2CH3;X代表F,Cl,Br,OH,NO2。所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。进一步,所述转化体系a中底物初始浓度为5~1000mmol/L。进一步,所述转化体系a中重组短链脱氢酶突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.1~2.0mg/mL。所述转化体系a中菌体的质量用量以菌体湿重计为1~400g/L。进一步,所述转化体系a还包括有机溶剂,由底物、催化剂、有机溶剂与pH5.5~10.5的缓冲液构成转化体系b,有机溶剂占转化体系b总体积1~20%,转化体系b中底物初始浓度为5~1000mmol/L本文档来自技高网
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短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用

【技术保护点】
一种短链脱氢酶的突变体,其特征在于:突变体为在SEQ ID No.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有以下几个位点的单点突变或多点组合突变:94位甘氨酸、145位组氨酸、153位丝氨酸、188位酪氨酸和193位亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种短链脱氢酶的突变体,其特征在于:突变体为在SEQIDNo.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有以下几个位点的单点突变或多点组合突变:94位甘氨酸、145位组氨酸、153位丝氨酸、188位酪氨酸和193位亮氨酸。2.根据权利要求1所述的短链脱氢酶的突变体,其特征在于,所述突变体在SEQIDNo.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上94位甘氨酸和153位丝氨酸其中一个位点进行取代或者两个位点同时进行取代。3.根据权利要求2所述的短链脱氢酶的突变体,其特征在于,所述突变体在SEQIDNo.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上94位甘氨酸和153位丝氨酸位点上两个位点同时进行取代。4.根据权利要求2所述的短链脱氢酶的突变体,其特征在于,所述突...

【专利技术属性】
技术研发人员:于洪巍李爱朋
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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