与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的亲和肽制造技术

本发明专利技术发现了一系列与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的亲和多肽YQC‑1和YQC‑2，这些多肽对柯萨奇病毒腺病毒受体特异性结合的性质将有可能实现特定恶性肿瘤的近红外成像，可用于细胞粘附抑制、肿瘤诊断或示踪的药物的制备、靶向型化疗以及用于药物辅料或连接物，从而达到实时无损在位监测早期恶性肿瘤的目的。本发明专利技术涉及与肿瘤诊断相关的药物领域，具体涉及多条多肽、其亲和试验以及这些多肽为有效成分的药物组合物以及它们在制备诊断药物中应用。

Affinity peptide related to Coxsackie virus adenovirus receptor

The present invention found a series of Coxsackie and adenovirus receptor affinity peptide YQC 1 and YQC 2, near infrared imaging properties of the peptide binding receptor specificity of Coxsackie virus adenovirus could achieve specific malignant tumor, can be used for inhibition of cell adhesion, tumor diagnosis or tracing drugs preparation, targeting chemotherapy and drugs for adjuvant or connection, so as to achieve the purpose of real-time nondestructive in situ monitoring of early malignant tumors. The invention relates to the field of drugs related to tumor diagnosis, in particular to a plurality of polypeptides, their affinity tests, and a pharmaceutical composition of these polypeptides as effective components, and their application in the preparation of diagnostic drugs.

【技术实现步骤摘要】
与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的亲和肽
本专利技术属于生物工程制药
和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对柯萨奇病毒腺病毒受体具有高亲和力多肽及其应用，例如用于癌症诊断和治疗中。
技术介绍
目前，癌症已成为危害我国居民健康的最大的罪魁祸首，严重威胁着人类的健康。临床上用于治疗肿瘤的方法有外科手术法、化学药物治疗、放射性治疗。其中，化学治疗法是目前肿瘤治疗最广泛使用的方法，在失去手术机会的晚期肿瘤患者中，化疗为其主要治疗手段；在合并有高危因素的手术患者术后，术后辅助化疗也已被证实可以降低术后肿瘤复发率；在乳腺癌等多种肿瘤中，术前新辅助化疗的地位也日益得到重视。CAR是柯萨奇B组病毒(CoxsackievirusB，CBV)和腺病毒(Adenovirus，Ad)与靶细胞结合的共同受体。1997年，Bergelson等首次分离出能编码CVB与Adv共同受体的cDNA克隆定位于人类染色体21q21-cen上，它编码一种含365个氨基酸的多肽，属于免疫球蛋白超家族。CAR分布广泛，且不同种属、组织的分布不同。在小鼠中，CAR分布于心、肝、脑、肾、肺等，且在肝脏中表达量最高。CAR分布广泛，且不同种属、组织的分布不同。在小鼠中，CAR分布于心、肝、脑、肾、肺、大肠等，在肝脏中表达量最高。在人体，许多组织器官能检测到CAR的mRNA，包括心、肝、脑、肾、肺、肠、胰以及睾丸等CAR在心脏、胰腺及动脉血管新生内膜的表达量非常丰富。值得注意的是，CAR在某些肿瘤及细胞系，如肝癌细胞系、宫颈癌细胞系、黑色素瘤等高度表达但在神经胶质瘤，前列腺癌，肾癌，膀胱癌，人卵巢癌细胞系等中存在着CAR表达的下降、丢失。作为参与柯萨奇病毒等的感染的蛋白质，已知柯萨奇病毒-腺病毒受体(COXSACKIEVIRUSANDADENOVIRUSRECEPTOR；CXADR)。另外，关于该蛋白质，被报告了在肝癌和皮肤基底细胞癌中表达亢进。另一方面，在胆管癌中确认了CXADR的纯合子缺失，启示了CXADR作为癌抑制基因发挥功能。这样，虽然有关于CXADR与癌的关联的报告，但是现状是CXADR是贡献于癌的发病、恶性化等，还是对癌发挥抑制作用尚未确定。因此，关于针对CXADR的抗体是否具有抗癌活性也尚不明。CAR在肿瘤中的作用一直被认为是肿瘤抑制因素。一些人类的恶性肿瘤，包括膀胱癌、前列腺癌及恶性神经胶质瘤中，CAR的表达水平随肿瘤恶性程度的发展而下调。对缺乏CAR表达的前列腺和神经胶质肿瘤细胞系进行CAR转染可导致细胞增殖活性和肿瘤形成能力的下降。在神经胶质瘤的体内外研究中，CAR均起到了肿瘤抑制功能，这为CAR在恶性的神经胶质瘤中表达下调提供了合理的解释CAR表达在其他的肿瘤中也有相似的下调现象，包括卵巢癌，恶性黑色素细胞瘤、头颈部肿瘤，肌肉骨骼系统肿瘤，不成熟的软骨母细胞瘤，人横纹肌肉瘤。目前抗体是证明对柯萨奇病毒腺病毒受体具有高亲和力的蛋白(详见专利：抗CXADR抗体，申请号201380024727.7)。本专利技术公开了能高度亲和柯萨奇病毒腺病毒受体的多肽，这些多肽能高效结合柯萨奇病毒腺病毒受体，从而靶向高表达该受体的肿瘤细胞，最终达到标记肿瘤细胞的效果。这些多肽可制备成诊断癌症的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能够与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的靶向多肽，使其能够对柯萨奇病毒腺病毒受体高表达的肿瘤进行在体诊断，可用于制备新型的靶向药物载体。本专利技术的目的还在于提供包含或部分包含YQC-1、YQC-2序列多肽或蛋白的分子作用方式，其结合柯萨奇病毒腺病毒受体，诱导细胞粘附降低。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有YQC-1、YQC-2的抗体作为体内外检测柯萨奇病毒腺病毒受体的有效成分。本专利技术所述的YQC-1、YQC-2肽是由腺病毒亲和基团结构优化得到，其具有天然氨基酸序列，免疫原性小，生物活性好。为了检测本专利技术多肽的药理活性，体外实验通过荧光染料罗丹明B对多肽进行标记，体内实验通过近红外染料ICG-Der-02对多肽进行标记，以检测其对肿瘤的体内外靶向性。在体外细胞亲和力实验和摄取实验中，本专利技术的YQC-1、YQC-2肽展现出了其良好的对肿瘤细胞柯萨奇病毒腺病毒受体的靶向能力。在体外细胞毒性实验中，本专利技术的YQC-1、YQC-2肽未表现出对细胞的毒性。详细
技术实现思路
如下：一、标记体外实验荧光染料本专利技术应用于体外细胞实验的荧光染料为罗丹明B(RhodamineB)，简称RhB，分别与本专利技术YQC-1、YQC-2肽通过酰胺键连接，简称分别为YQC-1-RhB与YQC-2-RhB，连接方法具体为取1mg罗丹明B(详见参考文献：Cao，J.，etal.，FastclearingRGD-basednear-infraredfluorescentprobesforinvivotumordiagnosis.ContrastMediaMolImaging，2012.7(4)：p.390-402)溶于1mlPBS(pH为7.4)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)(摩尔比RhodamineB∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5)，避光反应4h，活化。分别称取1mmolYQC-1、YQC-2肽溶入含有荧光染料罗丹明B的1mlPBS缓冲液(pH7.4)中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液(pH7.4)作洗脱液，得到纯化的YQC-1-RhB及YQC-2-RhB，-20℃储存备用。二、体外细胞亲和力实验将培养好的人肝癌HepG2和人脑胶质瘤U87MG细胞从12孔板上洗脱后重悬于PBS溶液，分别与罗丹明B标记的YQC-1、YQC-2肽(10umol/L)共孵育2小时，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度，荧光强度越强证明对细胞的亲和力越强。当探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高。体外亲和力实验结果显示浓度相同的标记了RhB的YQC-1、YQC-2肽的探针分别与柯萨奇腺病毒受体高表达的HepG2细胞孵育后，在HepG2细胞中YQC-1肽探针平均荧光强度为68，YQC-2肽探针平均荧光强度为344，空白染料平均荧光强度为5，结果表明这些探针在与HepG2细胞亲和力强弱对比中，本专利技术YQC-2的强度最大。而对柯萨奇腺病毒受体低表达的U87细胞，YQC-1和YQC-2多肽探针平均荧光强度都很低。说明其特异性很强。三、体外细胞摄取实验将培养好的人肝癌细胞HepG2和人脑胶质瘤U87MG细胞转移到共聚焦皿中，过夜孵育后分别加入相同浓度的罗丹明B标记的YQC-1和YQC-2肽(40umol/L)，37℃孵育4小时后，加入染核试剂12μg/mLHochest33342染色，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞内探针的摄取情况。在柯萨奇腺病毒受体高表达的HepG2和(图2A所示)，YQC-1和YQC-2肽探针显示出了很强的荧光强度，而在柯萨奇腺病毒受体低表达的U87细胞(图2B所示)，这两种探针的荧光强度不强，这一结果说明YQC-1和YQC-2肽探针对柯萨奇腺病毒受体高表达的细胞有靶向性而对柯萨奇腺病毒受体低表达的细胞靶向性不强。四、体外细胞毒性实本文档来自技高网...

【技术保护点】
对柯萨奇病毒腺病毒受体具有高亲和力的第一条多肽YQC‑1，该序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.对柯萨奇病毒腺病毒受体具有高亲和力的第一条多肽YQC-1，该序列为SEQIDNO：1。2.对柯萨奇病毒腺病毒受体具有高亲和力的第二条多肽YQC-2，该序列为SEQIDNO：2。3.根据权利要求1-2任一项所述多肽对柯萨奇病毒腺病毒受体特异性结合的性质将实现特定恶性肿瘤的近红外成像，可用于细胞粘附抑制、肿瘤诊断或...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾月清，赵梦路，韩智豪，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32