具有促进干细胞分化的支架材料及其制备方法和用途技术

一种支架材料，包括碳基纳米材料，天然高分子和一维无机纳米材料，碳基纳米材料与天然高分子之间经由酰胺键互交联，天然高分子之间经由酰胺键自交联，一维无机纳米材料吸附于天然高分子。本发明专利技术提供的支架材料，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的分化(如：骨向分化)，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞的分化(如：骨向分化)，并且在体内具有促进缺损组织(如：骨组织)再生修复功能。

Scaffold material for promoting differentiation of stem cells and preparation method and application thereof

A kind of scaffold materials, including carbon nano materials, natural polymer and one-dimensional inorganic nanomaterials, carbon nano materials and natural polymers through amide bond mutual cross-linking between natural polymers via amide bond self crosslinking, one-dimensional inorganic nanomaterials adsorption on natural macromolecule. Scaffold material provided by the invention can not only differentiate by chemical active nano materials (such as: the induction of stem cell differentiation and osteogenic differentiation), through the surface of the scaffold micro nano structure of stem cell regulation (e.g. osteogenic differentiation), and can promote the in vivo tissue defects (such as bone tissue regeneration) repair function.

【技术实现步骤摘要】
具有促进干细胞分化的支架材料及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种支架材料，尤其涉及一种由若干种材料交联而成的支架材料，具有促进干细胞分化的作用，以及制取的方法和用途。
技术介绍
外伤骨折、炎症、肿瘤和先天异常等均会造成骨缺损，将人工支架材料植入骨缺损处是国际公认的骨缺损修复方法。目前在研的生物支架普遍存在生物惰性问题，主要表现为缺乏骨诱导活性，不能有效诱导自体骨再生，尤其对于眼眶骨这类骨壁菲薄，骨髓腔少，局部血供差，骨再生能力弱的骨组织，缺损骨的自我修复更加困难。为了提高支架材料的骨诱导活性，有大量研究利用干细胞基因调控(Int.J.Mol.Med.，2010，26，517～525)和生长因子诱导等方法(PNAS，2014，111，12847～12852；Biomacromolecules，2014，15，1019～1030)提高支架材料修复骨缺损的能力，但是却面临生物安全性、生长因子活性和经济成本等新的问题。因此，从根本上提高支架材料的生物活性是发展组织工程支架材料的关键。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种支架材料，具有良好生物活性，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的分化，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞的分化。本专利技术的另一个目的在于提供一种支架材料，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的骨向分化，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞骨向分化。本专利技术的再一个目的在于提供一种制取支架材料的方法，通过化学交联反应制备具有良好促进组织再生功能的纳米复合生物活性支架。本专利技术的又一个目的在于提供一种制取支架材料的方法，通过化学交联反应制备具有良好促进骨再生功能的纳米复合生物活性支架。本专利技术的又一个目的在于提供一种支架材料在组织修复中的应用。本专利技术的又一个目的在于提供一种支架材料，在骨缺损修复中的应用。一种支架材料，其内部为多孔结构，孔隙率为90％以上，空隙外径为200±10μm。另一种支架材料，其表面的羟基含量为40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可对支架材料表面的官能团进行定量分析另一种支架材料，其表面的羧基含量为40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可对支架材料表面的官能团进行定量分析。另一种支架材料，其表面具有羧基和羟基等基团，还具有纳米级的凸起结构，凸起高度为1nm～100nm。另一种支架材料，包括碳基纳米材料，天然高分子和一维无机纳米材料，碳基纳米材料与天然高分子之间经由酰胺键互交联，天然高分子之间经由酰胺键自交联，一维无机纳米材料吸附于天然高分子。另一种支架材料，按重量份，包括0.1～1碳基纳米材料、1～5天然高分子和1～5一维无机纳米材料。碳基纳米材料如：但不仅限于氧化石墨烯，石墨烯量子点和碳纳米管等。天然高分子材料如：但不仅限于胶原蛋白，水溶性壳聚糖和丝素蛋白等。一维无机纳米材料如：但不仅限于纳米羟基磷灰石纳米粒子(nHA)、纳米二氧化硅纳米粒子(nSiO2)等，粒径为1nm～100nm。一种制取支架材料的方法，包括如下步骤：先制得浓度1w/v％～5w/v％天然高分子(如：2w/v％)和浓度0.1w/v％～1w/v％碳基纳米材料(如：0.2w/v％)的混合液，再加入一维无机纳米材料(如：浓度至1w/v％～5w/v％)，一维无机纳米材料经静电吸附作用而吸附于天然高分子上，制得一维无机纳米材料/碳基纳米材料/天然高分子混合水溶液；加入缩合剂和活化剂，搅拌均匀后，室温静置交联2小时，得纳米复合水凝胶；所得纳米复合水凝胶进行预冰冻处理(如：放置-40℃冰箱里24hr)，之后进行冷冻干燥，得到支架材料预产物，用去离子水超声清洗3次，每次5分钟，再经冷冻干燥，得到支架材料。缩合剂如：但不仅限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，J.Org.Chem.1961，26，2525)。活化剂如：但不仅限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。本专利技术的支架材料具有组织诱导活性，无需使用组织分化培养基，即能促进接种其上的细胞(如：骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞)进行组织分化，如：在支架材料上接种干细胞，体外非成骨分化培养基培养7天，待细胞贴壁增殖良好后，将纳米复合支架材料移植到体内非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损处，移植后随访观察3月，CT检查缺损部位骨修复效果良好。由此可见，在目前大部分细胞成骨分化都是在分化培养基的培养条件下进行，本专利技术具有在非成骨分化培养基培养环境下，三维支架通过化学诱导作用和表面微纳结构作用促进细胞成骨分化。本专利技术技术方案实现的有益效果：本专利技术提供的支架材料，是具有良好组织诱导(如：硬骨组织诱导和软骨组织诱导)活性的纳米复合支架材料，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的分化(如：骨向分化，以及向软骨分化等)，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞的分化(如：骨向分化，以及向软骨分化等)。在非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损时，作为组织工程支架体外接种干细胞后，移植在缺损部位，促进新骨的再生并修复缺损骨组织。附图说明图1A为本专利技术nHA/GO/CMC交联10分钟后的形貌图；图1B为本专利技术nHA/GO/CMC交联2小时后的形貌图；图2A为本专利技术nHA/GO/CMC支架材料形貌图；图2B为本专利技术nHA/GO/CMC支架材料扫描电镜图；图3为本专利技术细胞成骨分化后成骨相关因子基因表达水平图；图4为本专利技术细胞成骨分化后成骨相关蛋白表达水平凝胶电泳图；图5为本专利技术细胞在nHA/GO/CMC复合支架生长7天后碱性磷酸酶染色结果和生长14天后茜素红染色结果图；图6为本专利技术细胞在nHA/GO/CMC复合支架生长7天后的荧光照片。具体实施方式以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。本专利技术实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。实施例1支架材料修复大鼠颅盖骨缺损(1)称取4g羧甲基壳聚糖(CMC)溶解于100mL去离子水中得到4％(w/v)CMC水溶液；称取0.4g氧化石墨烯(GO)溶解于100mL去离子水中，并超声(200W，80％)1个小时得到黄褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。(2)取5mL4％(w/v)CMC水溶液与5mL0.4％(w/v)GO水溶液磁力搅拌混合，再放置在超声发生器中超声(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)GO和0.2％(w/v)CMC充分混合的水溶液。(3)称取0.1gnHA加入到上述混合水溶液中，超声(200W，80％)分散1h，获得均匀分散的nHA/GO/CMC混合溶液。(4)取上述10mLnHA/GO/CMC混合溶液中加入1mL1mMEDC水溶液和250μL1mMNHS水溶液并迅速搅拌均匀，将混合后的溶液放置在室温下静止10min，得到nHA/GO/CMC凝胶，并在室温下再静止2hr，得到充分交联的nHA/GO/CMC复合凝胶(如图1A和图1B)。(5)将nHA/GO/CMC复合凝胶进行放置在-40度冰箱里进行预冰冻处理24hr，之后放置冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到nHA/GO/CMC复合支架本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种支架材料，其特征在于包括碳基纳米材料，天然高分子和一维无机纳米材料，所述的碳基纳米材料与所述的天然高分子之间经由酰胺键互交联，所述的天然高分子之间经由酰胺键自交联，所述的一维无机纳米材料吸附于所述的天然高分子。

【技术特征摘要】
1.一种支架材料，其特征在于包括碳基纳米材料，天然高分子和一维无机纳米材料，所述的碳基纳米材料与所述的天然高分子之间经由酰胺键互交联，所述的天然高分子之间经由酰胺键自交联，所述的一维无机纳米材料吸附于所述的天然高分子。2.一种支架材料，其特征在于，按重量份，包括0.1～1碳基纳米材料，1～5天然高分子和1～5一维无机纳米材料，所述的碳基纳米材料与所述的天然高分子之间经由酰胺键互交联，所述的天然高分子之间经由酰胺键自交联，所述的一维无机纳米材料吸附于所述的天然高分子。3.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于所述的支架内部为多孔结构，孔隙率为90％以上，空隙外径为200±10μm。4.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于其表面具有羧基和羟基之一种或几种。5.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于其表面具有纳米级的凸起结构，凸起高度为1nm～100nm。6.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于其表面的羟基含量为40mol％～50mol％，羧基含量为40mol％～50mol％。7.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于所述的碳基纳米材料选自于氧化石墨烯，石墨烯量子点和碳纳米管之一种或几种。8.根据权利要求1或2所述的支架材料，其特征在于所述的天然高分子材料选自于胶原蛋白，水溶性壳聚糖和丝素蛋白之一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：范先群，阮静，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31