一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用制造技术

技术编号:15308813 阅读:188 留言:0更新日期:2017-05-15 16:26
本发明专利技术公开了一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用,肿瘤细胞裂解液包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂,所述裂解细胞膜成分选自化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯。本发明专利技术化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯可温和诱导肿瘤细胞细胞膜破裂,不破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象,用其配置的肿瘤细胞裂解液能最大限度保持裂解物的抗原性,将DC与用上述裂解液裂解的肿瘤细胞裂解物共同培养得到的裂解物致敏DC疫苗具有优异的抗肿瘤效果,并与现有技术常用的冻溶裂解法进行了比较,结果本发明专利技术肿瘤细胞裂解液显著优于传统裂解液,对肿瘤的预防、治疗效果与冻溶裂解接近。

Cell lysate, reagent kit and application in preparing tumor whole cell antigen loaded DC tumor vaccine

The invention discloses a cell lysate kit, and in the preparation of the whole tumor cell antigen load using DC tumor vaccine, tumor cell lysates including buffer composition, isotonic system composition, cracking membrane composition, protein stabilizer and protease inhibitors, the cleavage of cell membrane component selected from the group consisting of castor oil sulfonate compounds or ricinoleate. The compounds of the invention of castor oil sulfonate or ricinoleic acid esters can be mild to induce tumor cell membrane rupture, advanced conformation does not destroy the cell membrane protein and cytoplasmic protein with tumor cell lysate, the configuration can keep the maximum antigenicity of lysates of DC with tumor cell lysates on the lysis of the co culture the lysate sensitized DC vaccine has excellent antitumor effect, and with the existing technology commonly used in freezing compared dissolution pyrolysis method. The result of the invention of tumor cell lysates were significantly better than the traditional lysate of tumor prevention and treatment effect of freeze-thaw and close to cracking.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用
本专利技术属于肿瘤免疫领域,涉及肿瘤细胞裂解液,具体涉及一种细胞裂解液、裂解试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用。
技术介绍
免疫治疗是手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方式,在肿瘤的综合治疗模式中,免疫治疗在提高肿瘤治愈率、改善患者生活质量、延长生存期方面起重要作用。在肿瘤免疫中,T淋巴细胞识别的肿瘤抗原不是被肿瘤细胞提呈,而是被抗原提呈细胞提呈。树突状细胞(DC)是人体内目前已知功能最强大、唯一能激活静息状态T细胞的抗原提呈细胞,具有强大的激活辅助和细胞毒T细胞的能力。树突状细胞肿瘤疫苗是肿瘤治疗的第四模式之一,有望成为一种很有实用前景的抗肿瘤方法。肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗是由树突状细胞经肿瘤细胞裂解物或完整肿瘤细胞(两种最常用的全细胞抗原)致敏形成,致敏树突状细胞能表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子,使疫苗的抗肿瘤作用明显提高。将树突状细胞与肿瘤细胞裂解物共同培养得到的致敏树突状细胞称为裂解物致敏DC疫苗;将树突状细胞与完整肿瘤细胞进行细胞融合得到的疫苗称为融合疫苗。相对而言,裂解物致敏DC疫苗技术难度相对较小,易于操作。肿瘤细胞裂解物的获得方法主要有两种:化学裂解和物理裂解。物理裂解包括反复冻溶法(又称为热休克法)和超声波处理法。化学裂解包括裂解液裂解和酶裂解。四种方法比较而言,超声波处理法最为剧烈,容易造成DNA断裂和蛋白质变性;酶裂解用在裂解物致敏DC疫苗方面最容易破坏肿瘤细胞裂解物,降低抗原性;反复冻溶法最为温和,裂解效率也高,但是冻溶裂解需要将肿瘤细胞于-80℃和37℃反复冻融4个循环以上,操作耗费时间,且不易商品化、标准化;裂解液裂解比超声波处理法温和,没有酶裂解法对肿瘤细胞裂解物破坏性强,比冻溶裂解法快捷方便,唯一的不足就是还是会一定程度上造成肿瘤细胞裂解物中抗原成分高级构象的破坏,降低抗原性。现有技术中,为了最大限度保留肿瘤细胞裂解物中蛋白的抗原性,冻溶裂解法较为常用,如赵增仁等采用液氮反复冻融法制备人胃癌OCUM-2MD3肿瘤抗原(肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率,第四军医大学学报),古涛等采用-80℃和37℃反复冻融4个循环再离心取上清的方法制备小鼠骨髓瘤SP2/0细胞裂解物(肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究,中国病理生理杂志)。因此,如果能开发一种对肿瘤细胞裂解效率高且能最大限度保持裂解物抗原性的裂解液,裂解液裂解法必将取代冻溶裂解法而一枝独秀!细胞裂解液的主要目的包括如下两个方面:(1)破坏脂质双分子层,使细胞破裂;(2)抑制蛋白酶活性,防止蛋白被蛋白酶水解。因此,现有技术中,各大实验室自行配制的细胞裂解液或市售的细胞裂解液试剂盒主要包含以下成分:多种细胞裂解成分和蛋白酶抑制成分。当然还有其他一些成分。裂解液中常添加的化学成分有:Tris-HClpH7.4(缓冲体系)、NaCl(等渗体系)、EDTA(变性剂和稳定剂)、Sodiumdeoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)、SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)、PMSF(强大的蛋白酶抑制剂)、Aprotinin(蛋白酶抑制剂)、Leupeptin(蛋白酶抑制剂)、脱氧胆酸钠(强去污剂,破坏细胞膜)、TritonX-100(非离子型表面活性剂,破坏细胞膜)、CHAPS(离子型表面活性剂,破坏细胞膜)。添加蛋白溶解剂的一般主要目的是为了获得裂解液中的核酸,而不太在乎抗原等蛋白质成分。细胞裂解液的成分及浓度对实验效果的影响不容小觑。刘友平等(不同细胞裂解液对肝细胞蛋白提取影响的研究,山西医药杂志2005年1月第34卷第1期)配制不同组成和不同浓度的细胞裂解液,分别对相同条件下培养的肝细胞进行裂解并进行蛋白定量及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)佐证,结果发现不同组成及不同浓度的细胞裂解液对肝细胞裂解作用存在显著差异,两性去污剂CHAPS配制4%浓度时能有效溶解膜蛋白,而肝细胞膜蛋白本身就很丰富,同时,胞质中的蛋白质也可以彻底释放出来,因此提取的蛋白量较多。王丽等(不同细胞裂解液提取总蛋白在免疫印迹中的效果分析,泸州医学院学报2010年第33卷第4期)为了寻找一种适合乳腺癌细胞MCF-7蛋白提取的裂解液配方用于免疫印迹分析,测试了两种裂解液A(50mMpH7.4Tris-HCl,150mMNaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1mMEDTA,临用前加入PMSF使终浓度为1mM)和B(50mMpH7.4Tris-HCl,150mMNaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠,1mMEDTA,临用前加入PMSF使终浓度为1mM),结果发现2种细胞裂解液均可满足免疫印迹分析的要求,B液提取的蛋白含量虽比A液高,但A液用于免疫印迹检测β-actin和Twist的效果更佳。由上述
技术介绍
可得出如下结论:裂解液裂解法要想最大限度保持裂解物的抗原性,一方面要避免裂解液中的外来成分破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象;另一方面要避免细胞内裂解后释放出的内在蛋白酶对细胞膜蛋白和细胞质蛋白进行水解。
技术实现思路
本专利技术旨在克服
技术介绍
中裂解液裂解法存在的不足,提供一种肿瘤细胞裂解液及其试剂盒,以最大限度地保持裂解物的抗原性。本专利技术通过如下技术方案得以实现:化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯在诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂方面的应用。优选地,所述化合物蓖麻油磺酸盐为蓖麻油磺酸钠或蓖麻油磺酸钾。优选地,所述化合物蓖麻油酸酯为蓖麻油酸乙酯。一种肿瘤细胞裂解液,包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂,所述裂解细胞膜成分选自上述化合物。优选地,所述缓冲体系成分为50mMpH为7.4的Tris-HCl。优选地,等渗体系成分为150mMNaCl。优选地,蛋白稳定剂为0.5mMEDTA。优选地,所述蛋白酶抑制剂为5μg/mlAprotinin或5μg/mlLeupeptin或1mMPMSF。上述肿瘤细胞裂解液在制备肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗中的应用。一种肿瘤细胞裂解试剂盒,包括上述缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂。本专利技术优点:本专利技术发现化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯可以温和诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂,不破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象,用其配置的肿瘤细胞裂解液能最大限度地保持裂解物的抗原性,将树突状细胞与用上述裂解液裂解的肿瘤细胞裂解物共同培养得到的裂解物致敏DC疫苗具有优异的抗肿瘤效果,并与现有技术常用的冻溶裂解法进行了比较。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案,下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料,属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1:肿瘤细胞裂解液的制备和应用一、实验材料C57BL/6小鼠为8周龄雌性SPF级,购自南京大学动物中心;C57BL/6小鼠来源的肺癌细胞系3LL为本公司保存;DMEM培养基、胎牛血清购于Gibco公司。其它所用试剂均为国产或进口分析纯。二、实验方法1、小鼠骨髓DC的分离制备和鉴定脱颈处死C本文档来自技高网
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【技术保护点】
化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯在诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂方面的应用。

【技术特征摘要】
1.化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯在诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述化合物蓖麻油磺酸盐为蓖麻油磺酸钠或蓖麻油磺酸钾。3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述化合物蓖麻油酸酯为蓖麻油酸乙酯。4.一种肿瘤细胞裂解液,包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂,其特征在于:所述裂解细胞膜成分选自权利要求1-3任一所述化合物。5.根据权利要求4所述的肿瘤细胞裂解液,其特征在于:所述缓冲体系成分为50mMpH为7.4的Tris-HCl。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡攀勇陈曦
申请(专利权)人:南京佰泰克生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:江苏,32

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