一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法技术方案

本发明专利技术属于药物制剂领域和基因疫苗载体给药领域，具体涉及一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法。该递送系统以二代赖氨酸取代的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE‑G2)作为DNA载体材料，以柠康酰聚丙烯胺(PAH‑Cit)作为pH敏感性电荷反转材料，以甘露糖化壳聚糖(MCS)作为树突细胞靶向性材料，通过层层自组装的方式将上述材料有机结合形成四元复合物作为DNA疫苗递送系统，实现DNA疫苗对树突细胞的程序化转染，提高转染效率。本发明专利技术的DNA疫苗递送系统能形成稳定的复合纳米粒，特异性靶向树突细胞表面的甘露糖受体，在内涵体‑溶酶体系统的弱酸环境下电荷反转破坏复合纳米粒结构，促进DNA的释放，最终显著提高基因转染效率，具有很大的应用潜力。

Dendritic cell targeted pH responsive type DNA vaccine delivery system and preparation method

The invention belongs to the field of pharmaceutical preparation and the field of gene vaccine carrier administration, in particular to a pH responsive DNA vaccine delivery system of dendritic cells targeted and a preparation method thereof. The delivery system to replace two derai amino acid two stearic acyl phosphatidylethanolamine (DSPE G2) as DNA carrier material with citraconic acyl amine polypropylene (PAH Cit) as pH sensitive material to charge reversal, mannosylated chitosan (MCS) as a dendritic cell targeting material, through the layers the self-assembled materials form the organic combination of the above four Yuan compound as a DNA vaccine delivery system, implement the program of the transfected DNA vaccine on dendritic cells, improve the transfection efficiency. The composite nanoparticles DNA vaccine delivery system of the invention can form a stable, specific targeting of dendritic cell surface mannose receptor, in the failure of the complex structure of the nanoparticles endosomes of the lysosomal system in acid environment charge reversal, promote the release of DNA, significantly improve the final gene transfection efficiency, has great potential.

【技术实现步骤摘要】
一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法
本专利技术属于药物制剂领域和基因疫苗载体给药领域，具体涉及一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法。
技术介绍
疫苗是预防和治疗癌症、丙型肝炎、艾滋病、流感等疾病的有效方法。而DNA疫苗相比于传统疫苗，具有稳定、易于修饰与制备、安全性、能形成长期体液免疫和细胞免疫等方面的优势，而成为疫苗发展的新方向。然而，DNA疫苗的递送过程存在酶解、低吸收、转染效率低、抗原递呈不足等方面的风险。因此，选择合适的DNA疫苗递送载体对于发展至关重要。首先，将DNA疫苗靶向递送至抗原递呈细胞，如巨噬细胞和树突细胞能显著提高摄取与递呈效率。CN104771764A公布了一种巨噬细胞靶向载体系统，通过甘露糖修饰载体靶向抗原递呈细胞表面过量表达的甘露糖受体。然后，DNA疫苗进入内涵体-溶酶体系统，突破溶酶体进入细胞质是DNA疫苗所编码抗原表达的必要步骤。电荷反转材料能响应环境pH的变化，通过化学键的断裂改变自身电性，pH响应型释放DNA。最后，带正电荷的DNA载体材料通过质子海绵效应突破溶酶体到达细胞质，使DNA进入细胞核进行表达。具有仿病毒结构的两亲性树状脂肽其兼具非病毒载体的安全性和病毒载体的高转染效率。高转染效率有助于表达足量抗原，触发后续的主要组织相容性复合物I介导的细胞免疫和主要组织相容性复合物II介导的体液免疫。虽然靶向性材料、电荷反转材料、DNA载体材料能分别发挥其作用，但是要将它们有机地结合起来并根据递送过程中的环境变化发挥程序化转染的作用仍然需要借助层层自组装的技术。层层自组装是利用静电作用将带正电荷和带负电荷的聚合物依次沉积于内核表面。通过调整聚合物的浓度与用量避免聚沉而形成稳定的纳米粒。层层自组装技术是一种成熟的技术，已被广泛地应用于药物、蛋白、基因递送系统的构建中。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术的目的是通过层层自组装构建一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，降低细胞毒性，提高转染效率，进而增强后续的免疫反应。为实现上述目的，本专利技术采用的方案如下：一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，包括DNA载体材料DSPE-G2、电荷反转材料PAH-Cit和靶向性材料MCS，其特征在于，由两亲性的树状脂肽DSPE-G2压缩DNA形成的正电性纳米粒作为层层自组装的内核，在其表面覆盖阴离子聚电解质PAH-Cit作为电荷反转层，再在其表面覆盖阳离子聚电解质MCS作为外层靶向树突细胞。从而形成粒径为256.8±10.7nm、分散系数为0.104、表面电位为25.1±2.3mV的四元复合物纳米粒。所述的DSPE-G2的结构为：所述的电荷反转层PAH-Cit在酸性条件下酯键断裂，脱去柠康酰支链，形成阳离子聚电解质聚丙烯胺。所述的外层MCS具有靶向树突细胞表面甘露糖受体功能，进而促进受体介导的内吞作用。为实现上述目的，本专利技术采用的制备方法如下：a、DNA载体的制备：将2mgDSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速搅拌中的HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，持续搅拌6h除去有机溶剂。b、二元复合物的制备：将pDNA溶于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，调整浓度为0.2mg/mL。将pDNA溶液与浓度为0.1-2mg/mL的DSPE-G2溶液等体积混合，涡旋1min，室温孵化20min。c、三元复合物的制备：将PAH-Cit溶于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，调整浓度为1mg/mL、2mg/mL。取50-200μLPAH-Cit溶液与100μL二元复合物溶液混合，室温孵化30min。d、四元复合物的制备：将MCS溶于1％(v/v)醋酸溶液，静置过夜，用1MNaOH调节pH＝5.5，过0.8μm滤膜，调整浓度为0.5mg/mL。取150-300μL三元复合物溶液逐滴加入300μL搅拌中的MCS溶液，持续搅拌30min。在上述制备过程中，不同浓度DSPE-G2与pDNA复合的N/P比为1-20，优选的N/P比为20。在上述制备过程中，PAH-Cit与二元复合物需按照DSPE-G2与PAH-Cit的浓度比为1∶1，质量比为1∶1的比例混合。在上述制备过程中，MCS与三元复合物需按照PAH-Cit与MCS的浓度比为4∶1，质量比为2∶3的比例混合。本专利技术制备的DNA疫苗递送系统可用于靶向递送DNA疫苗到树突细胞，实现程序化转染。相比于现有技术，本专利技术具有如下优点：1、由于外层壳聚糖衍生物甘露糖配体的引入，该DNA疫苗递送系统具有很好的树突细胞靶向性。2、该DNA疫苗递送系统具有pH响应，经树突细胞摄取进入内涵体-溶酶体系统后，电荷反转层在酸性环境刺激下电性由负变正，快速释放含DNA的内核。3、具有仿病毒结构的DNA载体材料DSPE-G2能有效压缩DNA，而且能显著提高DNA的转染效率，表达足量的抗原，促进机体产生免疫反应。4、本专利技术所用的材料都具有良好的生物相容性和生物可降解性，细胞毒性小，安全性高。5、本专利技术制备方法简单，反应条件温和可控，具有广阔的应用前景。附图说明图1二元复合物的凝胶阻滞电泳图图2二元复合物随N/P比的粒径、电位变化图图3四元复合物的透射电镜图图4DSPE-G2的细胞毒性评价图5DNA疫苗递送系统的细胞毒性评价图6DNA疫苗递送系统的荧光显微镜观察体外转染图具体实施方式下面具体实施例是对本专利技术的进一步说明，但下述仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例1：DNA载体的制备将2mgDSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速搅拌中的HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，持续搅拌6h除去有机溶剂。用激光粒度分析仪测定DSPE-G2纳米粒的粒径分布与表面电位。结果表明，DSPE-G2纳米粒的粒径为296.3±19.6nm，分散系数为0.269，表面电位为31.5±6.1mV。实施例2：二元复合物的制备将pDNA溶于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，调整浓度为0.2mg/mL。用HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)调节DSPE-G2溶液浓度为0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、1、1.5、2mg/mL。将不同浓度的DSPE-G2溶液与pDNA溶液等体积混合，对应N/P比为1、2、4、5、6、10、15、20，涡旋1min，室温孵化20min。对二元复合物进行凝胶阻滞实验，检验DSPE-G2对pDNA的压缩能力。取10μL二元复合物溶液与上样缓冲液混合，加入含Goldview核酸染料的1％琼脂糖凝胶上样孔中，浸入TAE电泳缓冲液中，恒压90V电泳30min。紫外灯下观察凝胶阻滞条带。结果表明，当N/P比≥4时，DSPE-G2能完全压缩pDNA，将其阻滞于加样孔中而不向正极迁移(附图1)。用激光粒度分析仪测定二元复合物的粒径分布与表面电位，进一步优化N/P比。N/P比从5增加到20的过程中，粒径从＞400nm降至250nm左右并趋于平稳。电位从接近0mV增加到30mV左右并趋于平稳。说明随着DSPE-G2用量的增加，能更好地压缩pDNA形成紧致的内核，而且表明正电性的增加有利于PAH-Cit电荷反转层的吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，其特征在于，它是由DSPE‑G2与DNA复合形成的正电性纳米粒作为层层自组装的内核，在其表面依次覆盖电荷反转层PAH‑Cit和靶向层MCS。

【技术特征摘要】
1.一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，其特征在于，它是由DSPE-G2与DNA复合形成的正电性纳米粒作为层层自组装的内核，在其表面依次覆盖电荷反转层PAH-Cit和靶向层MCS。2.根据权利要求1所述的一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，其特征在于，所述的DSPE-G2的结构为：3.根据权利要求1所述的一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，其特征在于，所述的电荷反转层PAH-Cit在酸性条件下酯键断裂，脱去柠康酰支链，形成阳离子聚电解质聚丙烯胺。4.根据权利要求1所述的一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，其特征在于，所述的外层MCS具有靶向树突细胞表面甘露糖受体功能，进而促进受体介导的内吞作用。5.一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：a、DNA载体的制备：将2mgDSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速搅拌中的HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，持续搅拌6h除去有机溶剂。b、二元复合物的制备：将pDNA溶于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，调整浓度为0.2mg/mL。将pD...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜雷，宗莉，徐梦露，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32