一种通过固体发酵微生物Clonostachys rogersoniana产生抗生素TMC-154的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过微生物固体发酵产生抗生素TMC‑154的方法。即：微生物Clonostachys rogersoniana 828H2(CGMCC No.12073)在合适的培养条件下固体发酵，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，经硅胶和凝胶柱层析分离得到抗生素TMC‑154。结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的TMC‑154的产生。TMC‑154对人体白血病早幼粒细胞株HL‑60，人体肝癌细胞株SMMC‑7721，人体非小细胞肺癌细胞株A‑549，人体乳腺癌细胞株MCF‑7及人体结肠癌细胞株SW‑480都表现出明显的抑制活性，其半数抑制率(IC

A method for the production of antibiotic TMC 154 by microbial solid fermentation of Clonostachys rogersoniana

The invention discloses a method for producing antibiotic TMC 154 by microbial solid fermentation. That is: Clonostachys rogersoniana 828H2 microorganism (CGMCC No.12073) solid under appropriate culture conditions of fermentation, after appropriate solvent ultrasonic extraction, filtration, concentration, antibiotic TMC 154 by silica gel and gel column chromatography. TLC combined with TLC and HPLC, detectable amounts of TMC 154 generation. TMC 154 on human promyelocytic leukemia cell line HL 60 human hepatocellular carcinoma cell line SMMC 7721, human non-small cell lung cancer cell line A 549 human breast cancer cell line MCF and 7 human colon cancer cell line SW 480 showed obvious inhibitory activity, the inhibition rate (half of the value of IC50) were 2.13 M, 15.38 M, 17.49 M, 15.80 M and 14.54 M, with the development of drugs for potential. This method provides a new method for the production of antibiotic TMC 154.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物代谢产物分离分析领域，具体来说建立了一种通过固态发酵微生物Clonostachysrogersoniana产生抗生素TMC-154的方法。本专利技术使用的微生物Clonostachysrogersoniana：[Clonostachyssp828H2(保藏号：CGMCCNo.12073)]保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2016年1月15日。
技术介绍
近年来，因微生物具有代谢周期短、转化反应条件温和、副产物少、立体选择性强等特点，通过微生物(真菌、细菌以及藻类)发酵来制备特定化合物的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物发酵来生产一些新颖的、活性较高的以及对人体健康有益的药物。TMC-154是聚酮苷类化合物，其结构特征在于具有一个独特的高度甲基化的erythromycins类型聚酮母核、一个阿拉伯醇侧链和一个甲基甘露糖取代。文献报道该类化合物对多种肿瘤细胞具有生长抑制活性，且对二酰甘油乙酰转移酶(DGAT)具有抑制活性。在体外细胞毒活性筛选实验中，TMC-154对人体白血病早幼粒细胞株HL-60，人体肝癌细胞株SMMC-7721，人体非小细胞肺癌细胞株A-549，人体乳腺癌细胞株MCF-7及人体结肠癌细胞株SW-480均表现出明显的抑制活性，其半数抑制率(IC50值)分别为2.13μM，15.38μM，17.49μM，15.80μM和14.54μM。而阳性对照顺铂对五株人类肿瘤细胞HL-60，A-549，SMMC-7721，MCF-7和SW-480的IC50值依次为1.72μM，6.82μM，12.19μM，17.40μM和16.35μM。TMC-154对人体乳腺癌细胞株MCF-7和人体结肠癌细胞株SW-480的生长抑制活性强于阳性对照顺铂。因此，TMC-154具有作为先导化合物开发抗肿瘤药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗生素TMC-154的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。
技术实现思路
本专利技术旨在通过Clonostachysrogersoniana固体发酵生产抗生素TMC-154。本专利技术提供了一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污染，适合产业化生产TMC-154的方法。本专利技术的目的是通过以下具体技术方案实现的：(1)将拟用微生物C.rogersoniana828H2(菌种保藏号CGMCCNo.12073)首先进行活化，即将C.rogersoniana828H2接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中备用；(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；(5)经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2DNMR以及HR-ESIMS鉴定得到TMC-154结构；(7)采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量。①色谱柱：ZORBAXSB-C18(4.6×250mm,5μm)；②梯度洗脱程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；③检测波长：235nm；④流速：1.0mL/min；⑤柱温：20℃。附图说明图1为本专利技术中目标化合物的1H-NMR；图2为本专利技术中目标化合物的13C-NMR；图3为本专利技术中目标化合物的HSQC；图4为本专利技术中目标化合物的HMBC；图5为本专利技术中目标化合物的HR-ESI-MS。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本专利技术，但本专利技术不局限于该具体实施例，本领域技术人员应该认识到，本专利技术涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。实施例1(1)将拟用微生物Clonostachysrogersoniana828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中备用；(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；(5)经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2DNMR以及HR-ESIMS鉴定得到TMC-154结构；(7)采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量为3.78g/Kg。①色谱柱：ZORBAXSB-C18(4.6×250mm,5μm)；②梯度洗脱程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；③检测波长：235nm；④流速：1.0mL/min；⑤柱温：20℃。该方法是一种高效的，具有创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量产生抗生素TMC-154的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础。实施例2操作同实施例1，把发酵时间改为35d后，TMC-154的产量为3.76g/Kg。实施例3操作同实施例1，把发酵时间改为40d后，TMC-154的产量为3.69g/Kg。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过微生物Clonostachys rogersoniana发酵产生抗生素TMC‑154的方法，其特征在于按如下步骤进行固体发酵：(1)将拟用微生物Clonostachys rogersoniana 828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana 828H2接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3‑7d后，置于4℃冰箱中备用；(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3‑7d；(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；(5)经微生物C.rogersoniana 828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC‑154的结构式如下：(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2D NMR以及HR‑ESIMS鉴定得到TMC‑154结构。(7)采用HPLC测定TMC‑154的产量为3.78g/kg。...

【技术特征摘要】
1.一种通过微生物Clonostachysrogersoniana发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于按如下步骤进行固体发酵：(1)将拟用微生物Clonostachysrogersoniana828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana828H2接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中备用；(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；(5)经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2DNMR以及HR-ESIMS鉴定得到TMC-154结构。(7)采用HPLC测定TMC-154的产量为3.78g/kg。2.根据权利要求1所述通过C.rog...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡乐，丁中涛，邢赟，尹田鹏，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53