一种喉癌细胞的核酸适配体及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种核酸适配体，其序列如SEQ ID NO：1或2所示。本发明专利技术还公开了该核酸适配体的筛选方法，首先合成随机单链DNA文库和引物，再经过多轮的Cell‑SELEX筛选步骤获得核酸适配体。本发明专利技术的核酸适配体可特异性结合喉癌细胞，具有高特异性识别能力。

Nucleic acid aptamer and kit for laryngeal cancer cell

The invention discloses a nucleic acid aptamer sequence, such as SEQ NO:1 or ID 2 shows. The present invention also discloses the aptamer screening method, the first synthesis of random single stranded DNA library and primer, after several rounds of Cell SELEX screening step to obtain aptamers. The nucleic acid aptamer specifically binds to laryngeal squamous cell carcinoma, highly specific recognition ability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸适配体领域，尤其涉及一种可用于检测人喉癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
技术介绍
喉癌是常见的头颈肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中发病率居第二位。有国内外调查表明，喉癌的发病率不断升高，每年大约增加25％。2008年世界上男性喉癌的发病率估计为5.1/100000，男性病人死亡率约为2.2/100000。近30年来新的外科手术方法、化疗药物及更先进的放射治疗手段已应用于喉癌的治疗中，与其他头颈癌一样，喉癌患者的总生存率并未得到提高，甚至有所下降。因此早期诊断是提高喉癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。核酸适配体(aptamer，也译为核酸识体、适配子)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment，SELEX)技术；所述的SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptideaptamer)，核酸适配体的优势相当明显，如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。为了能够得到能识别天然构象下膜蛋白的核酸适配体，发展了以细胞为靶标的SELEX技术，即cell-SELEX。与传统SELEX针对单一分子进行筛选不同，cell-SELEX的靶标为一个完整的活细胞。通过cell-SELEX技术已经获得了多类细胞系的核酸适配体，其中癌细胞系包括淋巴细胞性白血病细胞，骨髓性白血病细胞，肝癌细胞，小细胞肺癌细胞以及非小细胞肺癌细胞。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和应用。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以喉癌细胞株为正筛靶标，以鼻咽癌细胞株为反向筛选靶标，筛选与Hep-2特异结合的核酸适配体。本专利技术提供一种特异性结合人喉癌细胞的核酸适配体的方法，包括如下步骤：(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：随机文库：5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(40N)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’；上游引物：5’-FAM-ACAATGATCGAGTCGAGCAC-3’；下游引物：5’-Biotin-TGGACGGATGAGGCAAGCAG-3’；(2)SELEX筛选特异核酸适体文库：(3)PCR扩增文库；(4)DNA单链文库的制备；(5)反向筛选：以鼻咽癌细胞5-8F为对照，进行反向筛选；(6)正向筛选；(7)多轮筛选：将步骤6得到的DNA单链文库替代步骤4中的DNA单链文库，重复上述步骤5-6的操作；最终可得到富集度高的序列，即为可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体。本专利技术提供一种喉癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQIDNO：1-2所示。序列1：(SEQIDNO：1)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(TAGCACCGCTCGTAGGGGAATGCGTGTTGGACCACGGTGG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’序列2：(SEQIDNO：2)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(ATCGTGACTGCGGGATCTGTGAACGTCGACTGATCGTACG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’本专利技术中，所述的喉癌细胞选自候癌细胞株Hep-2。上述核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可被修饰。本专利技术提供一种喉癌的诊断试剂盒，其包含上述的核酸适配体。进一步地，本专利技术提供所述的核酸适配体在制备用于检测喉癌细胞的试剂中的应用。优选的，其中检测喉癌细胞的试剂为用于喉癌组织切片中喉癌细胞成像的试剂。其中所述喉癌细胞为Hep-2细胞。进一步地，本专利技术提供所述核酸适配体在制备治疗靶向喉癌的药物中的应用，所述适配体作为抗肿瘤药物的载体使用。本专利技术还提供所述的核酸适配体在制备喉癌的肿瘤标志物中的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术所涉及的核酸适配体具有特异性强，亲和性高，分子量小、稳定性好、制备简单、成本低、易修饰、无免疫原性的优点，并可实现快速的分子诊断。本专利技术中的各条适配体均能与靶细胞Hep-2稳定结合，而不与其他对照细胞结合。通过适当的修饰或者标记，可用于人喉癌的快速检测和诊断。此外，该核酸适配体其本身还可以作为药物或者药物载体，通过包封相应的药物或者治疗制剂可以实现人喉癌的靶向治疗。本专利技术对人喉癌的临床检测、诊断和治疗都具有非常重要的意义。附图说明图1为序列1、2所示的适配体与喉正常组织(A)、喉癌组织(B)切片的荧光强度差异比较。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1：特异性结合喉癌细胞的核酸适配体的筛选1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物。随机文库：5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(40N)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’；文库左端的固定序列即是上游引物，文库右端的固定序列与下游引物的序列反向互补。上游引物：5’-FAM-ACAATGATCGAGTCGAGCAC-3’下游引物：5’-Biotin-TGGACGGATGAGGCAAGCAG-3’。2.SELEX筛选特异核酸适体文库1)细胞培养：RPMI1640培养基加10％胎牛血清培养人喉癌细胞株Hep-2细胞至铺满瓶底95％，去除培养基后用10mLwashingbuffer洗涤，与1mL含1nM随机序列的bindingbuffer在冰上孵育15min，弃溶液；2)细胞结合：用500μLbindingbuffer溶解20nmol上述的随机文库，95℃加热5min后迅速放入冰中；在随机文库中补充bindingbuffer至终体积为1mL，与步骤2.1处理后的Hep-2细胞在冰上孵育30min。3)解离：孵育完后倒出孵育培养瓶内的液体，用10mL4℃的washingbuffer洗涤孵育培养瓶中的细胞，最后加入500μL的灭菌水，用细胞刮子将细胞轻轻刮下来，并收集至1.5mL的EP管中，然后再加入250μL的灭菌水将残留的细胞刮下并收集到EP管中，最后加入250μL的灭菌水将瓶壁和细胞刮子洗一遍，并收集洗涤液至EP管中，总体积1000μL。置于沸水中水浴10分钟后立即置于冰上冷却5分钟，12000rpm，4℃离心5分钟，取上清标记为“第一轮筛选文库”。3.PCR扩增文库：取100μL筛选所得的Hep-2特异核酸适配体文库本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能特异性结合人喉癌细胞的核酸适配体，其特征在于序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种能特异性结合人喉癌细胞的核酸适配体，其特征在于序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的核酸适配体，其中所述喉癌细胞为Hep-2细胞。3.如权利要求1-2任一项所述的核酸适配体，其中适配体的核苷酸序列上的某一位置可被修饰。4.一种喉癌的诊断试剂盒，其包含权利要求1-3任一项所述的核酸适配体。5.如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体在制备用于检测喉癌细胞的试剂中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其中检测喉癌细胞的试剂为用于喉癌组织切片中喉癌细胞成像的试剂。7.如权利要求5-6任一项所述的应用，所述喉癌细胞为Hep-2细胞。8.如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体在制备治疗靶向喉癌的药物中的应用，所述适配体作为抗肿瘤药物的载体使用。9.如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体在制备喉癌的肿瘤标志物...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟，
申请(专利权)人：朱伟，
类型：发明
国别省市：北京;11